研究报告
中国酿造
原生质体融合选育冠菌素高产菌株王晓飞1-2，吴晓五1-2*，刘好桔1-2，葬霞”，钟义军+
2011年第6期总第231期
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摘要：研究以抗卡那霉素突变株189(KM、Glu")和谷氨酸缺陷营养型突变株A4.6.727(Glu"、KM)为亲本，进行原生质体融合构建冠菌素高产菌株。确定了制备原生质体的适宜条件为溶菌酶浓度0.05mg/mL和酶解时间100min，此条件下原生质体形成率达79.1%，再生率为12.8%。所得融合子经多次转管培养，检测融合子发酵产冠菌素产量，最终筛选到一株高产冠菌素菌株S1893.其冠菌素相对产量比出发菌株提高184.1%和519.0%。
关键词：原生质体融合：冠菌素：抗药性；菌种选育
中图分类号：T93-331
文献标识码：A
文章编号：02545071(2011)06-0065-06
Breeding of high-yield coronatine-producing strain by protoplast fusion WANG Xiaofei'2, WU Xiaoyu*, LIU Haoju'2, GONG Xia', ZHONG Yijun*
(I.College of Bioscience and Bioengineering,Jiangxi Agricultura/ University,Nanchang 330045, Ching; 2.Nanchang Key Laboratory of Fermentation Application and Technology, Nanchang 330045, China; 3.College of Science, Jiangxi
Agricultural University,Nanchang330045, China; 4. Institute ofRed Soil, Nanchang30045, China)
Abstract: Using strain 189(KMP,Glu') and A4.6.727(Glu',KM) as parents strains, high coronatine-producing strain was constructed by protoplast fu-sion technology. The optimal conditions of preparing protoplast were as follows: the lysozyme concentration 0.05mg/mL and hydrolysis time 100min. Under these conditions, the efficiency of protoplast formation was 79.1% and the rate of protoplast regeneration reached 12.8%. The coronatine yields were determined after cultured repeatedly. Finally, a strain S1893 with high yield of coronatine was successfully screened. The relative yield of coronatine was increased by 184.1% and 519.0% compared to those of the original strains, respectively. The results demonstrated that the protoplast
fusion technology is one of the effective methods to obtain high-yield strain Keywords: protoplast fusion; coronatine; resistance; strain breeding
冠菌素（coronatine，简称COR）是20世纪70年代末发现的一种由微生物产生的生物活性物质目，其可以诱导植物组织肥大叫、抑制植物根的伸长围、促进乙烯的生成及促进水稻额花快速开发闯等，在农业生产上有广阔的应用前景。然而，由于冠菌素化学合成成本高，易造成环境污染；而生物合成的菌株产量偏低，制约了其在农业上的广泛应用网。因此有必要采用有效的微生物育种手段，筛选优良的产冠菌系素菌株，以期尽早工业化生产，将冠菌素应用于农业生产中周。各种微生物育种手段中，原生质体融合育种(protoplastfusion)），具有极大的优越性，相对于常用的自然筛选和透变育种，其用于微生物育种的目的性强，能够克服遗传障碍、实现优良性能的重组，成功的几率较大明，是工业微生物育种的重要方法之一。本研究拟用抗卡那霉素菌株189和谷氨酸缺陷型菌株A4.6.727叫为亲本，在促融剂PEG和Ca*的作用下进行原生质体融合，构建融合菌株，以期筛选到产冠菌素能力较强、稳定性好的菌株，为冠菌素的工业化生产奠定一定基础。
1材料和方法 1.1材料
收稿日期：2011-01-10
1.1.1菌种
菌株189，由野生菌株洋葱伯克霍尔德菌Burkholderia cepaciaBCC933诱变而来，由江西农业大学南昌市微生物重点实验室保藏。
菌株A4.6.727(Glur)保藏于江西农业大学南昌市微
生物重点实验室。 1.1.2试剂
溶菌酶（Lysozyme，Bebco，4000U/mg）（北京鼎国生物技术发展中心），PEG6000(广东汕头市西陇化工厂进口分装)，冠菌素纯品（日本北海道大学有机化学实验室馈赠，
纯度99.5%）。 1.1.3 培养基
活化培养基（金氏培养基)：蛋白陈20.0g，K,HPO，1.5g MgSO.·7H,O1.5g，琼脂18.0g，加蒸馅水定容至1000mL， pH7.2，121℃灭菌30min
基本培养基（低渗培养基)：葡萄糖10.0g，NHCI1.0g MgSO,7H,O0.2g,KH,PO,4.1g,K,HPO,·3H,O3.6g,FeCls 2umol/L，加蒸增水定容至1000mL，pH6.8～7.0,115℃灭菌 20min，固体培养基加琼脂18.0g。
基金项目：江西省教育厅项目(GJ09171)；江西省自然科学基金项目(2008GJN0016)资助
作者简介：王晓飞(1983-)，女，硕士研究生，研究方向为工业微生物育种；吴晓玉*，副教授，通讯作者。