·42·
2010 No.9
SerialNo.222
China Brewing
Research Report
酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母原生质体制备与再生研究
包伟霞，王静洁，王晓斐，陈由强，许旭萍*
（农业部甘燕遗传改良重点开放实验室福建师范大学生命科学学院，福建福州350108）
摘要：研究了菌龄、酶浓度、渗透压稳定剂及酶解时间等因素对酿酒醇母菌（Saccharomyces cerevisiae）和马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromycesmarxianus)原生质体形成与再生的影响。实验结果表明，原生质体形成与再生的最佳条件为酿酒醇母菌龄9h，采用 1.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶，30C酶解70min；马克斯克鲁维酵母菌龄8h，采用1.0%蜗牛酶+0.5%纤维素酶，30℃酶解时间50min；配制
酶液时渗透压稳定剂采用4%氧化钠高渗缓冲液，在稀释和配制再生培养基时则采用15%的蔗糖高渗缓冲液。关键词：酸酒醇母：马克斯克鲁维酵母：原生质体的形成与再生
中图分类号：TS261.1
文献标识码：A
文章编号：02545071(2010)09-004203
Protoplast formation and regeneration of Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces marxianus
BAO Weixia, WANG Jingjie, WANG Xiaofei, CHEN Youqiang, XU Xuping*(Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Ministry of Agriculture; College of Life Sciences, Fujian Nomal University, Fuzhou, 350108, China)
Abstract: Effects ofhypha age, enzyme concentration, stabilizer for osmotic pressure and enzymeolysis time on the protoplast formation and regenera tion of Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces marxianus were studied. The optimum conditions for protoplast formation and regeneration were as follows: S. cerevisiae aged at 9 h, hydrolysis with 1.5% snailase and 0.5% cellulase under 30°C for 70 min; K, marxianus aged at 8 h, hydrol-ysis with 1.0% snailase and 0.5% cellulase under 30°C for 50 min; 4% NaC1 for stabilization of osmotic pressure in preparation of enzymolysis solu-tion, and 15% cane sugar solution for dilution and medium of regeneration culture.
Key words: Saccharomyces cerevisiac, Kluyveromyces marxianus, protoplast fommation and regeneration
原生质体融合技术具有杂交频率高、重组种类多、遗传信息传递量大等优点，目前已广泛应用于微生物菌种的改良中。酿酒酵母Y01是一株具有良好发酵性能，能够利用甘蔗汁发酵生产酒精的优良菌株，但其最适生长温度为30℃，最适发酵温度为32℃，不能适应高温酒精发酵：而马克斯克鲁维酵母Y05具有较强的耐热性，在40℃时仍能正常生长，但是产酒率较低。为了得到一株既耐高温又高产酒精的新型酵母菌株，拟采用原生质体融合技术对酿酒酵母和马克斯克鲁维酵母进行杂交。原生质体的制备与再生是融合前提，据文献报道，酵母菌原生质体的再生较为困难，再生率较低。为了克服这一问题，本研究对两亲本的原生质体制备和再生条件进行了优化，为后续的原生质体融合育种创造条件。
1材料与方法 1.1材料
1.1.1实验菌种
酿酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）由本实验室保减，文中简称酵母菌Y01；马克斯克鲁维酵母菌（Kluyveromyces marxianus)1911购自中国工业微生物菌种保藏中心，文中
简称酵母菌Y05。 1.1.2 培养基
①YPD培养基：葡萄糖2%，蛋白陈2%，醇母浸出汁
收稿日期：2010-02-27
1%，pH值为5.4：②氟化钠高渗培养基：在YPD培养基中添加4%氯化钠，调pH值为6.0：③蔗糖高渗培养基：在YPD 培养基中添加15%蔗糖，调pH值为6.0：④甘露醇高渗培养基：在YPD培养基中添加15%甘露醇，调pH值为6.0。固体
培养基成分同上，另加2%琼脂，115℃灭菌30min。 1.1.3主要试剂
(1)PB溶液：pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
(2)高渗缓冲液(PBS)：①蔗糖高渗缓冲液：PB溶液加入15%蔗糖：②甘露醇高渗缓冲液：PB溶液加入15%甘露醇：③NaCI高渗缓冲减：PB溶液加入4%NaCI。以上试剂均115℃灭菌30min。
(3)脱壁酶：蜗牛酶和纤维素酶，使用时按所需浓度用高渗缓冲液配制，0.22um微孔滤膜过滤除菌（现配现用）。 1.2方法
1.2.1菌体培养
将酵母菌Y01和Y05分别转接一环入YPD液体培养基
中，酵母菌Y01置30C（Y05置37C）、200r/min振荡培养 24h。取上述培养物按0.3%的接种量接入新鲜的YPD液体培养基中，同上条件培养至一定时间，将细胞浓度调整为
3.5x10°个/mL~4.0x107个/mL，用于制备原生质体。 1.2.2原生质体的制备与再生
取上述培养的菌液5mL，4000r/min离心5min收集菌
基金项自：国家*948"项目基金(2006-G37)；农业公益性行业科研专项(nytyzx07-019)；福建省教育厅资助项目(IB09029）作者简介：包伟霞（1986-)，女，硕士研究生，主要从事微生物发酵研究工作；许旭萍*，教授，通讯作者。