128-
2011No.3 SerialNo.228
ChinaBrewing
酿酒酵母丙酮酸脱羧酶活性测定的研究
高年发，邓旭衡，王德培，李磊
（工业微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300457）
Research Report
摘要：丙酮酸脱胶酶是酿酒醇母代谢中非常关键的酶，其催化的反应是利用丙酮酸生成乙醛。研究构建了一种分光光度法测定酿酒醇母中丙耐酸脱羧酶活性的方法，在25℃和pH6.0的条件下测定反应液5min内在波长340mm处每分钟吸光度值的变化。以在25℃和
pH6.0的条件下每分钟转化1.0μmol丙耐酸生成乙醛来定义酶的活性。关键词：酿酒酵母：丙酮酸脱酵：测定
中图分类号：TS261.1
文献标识码：A
文章编号：0254-5071(2011)03-0128-03
Determination of pyruvate decarboxylase activity in Saccharomyces cerevisia
GAO Nianfa, DENG Xuheng, WANG Depei, LI Lei
(Key Laboratory of Industrial Microbiology ofMinistry of Education, College ofBiofechnology,Tianjin University of
Science and Technology, Tianjin 300457, China)
Abstract: Pyruvate decarboxylase, which catalyzes pyruvate to acetaldehyde, is a key enzyme in metabolic of Saccharomyces cerevisiae. A method for determination of pyruvate decarboxylase activity yeast with spectrophotometry was established in this paper. Changes of absorbance under 340nm per min at 25C, pH 6.0 were measured. One unit of activity of enzyme was defined as conversion 1.0μm of pyruvate to acetaldehyde per minute under the conditions of pH 6.0, 25
Key words; Saccharomyces cerevisiae, pyruvate decarboxylase; determination
酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）是重要的模式生物，具有广泛的科研应用价值，其基因组序列已经全部完成，并且80%的基因功能已得到鉴定。越来越多的科研工作者开始把酿酒酵母作为遗传工程研究的菌株。但是采用酿酒酵母作为重组宿主也有不少缺点，尤其是会生
收稿日期：2010-10-09
成乙醇，这是研究者最不希望看到的，因为这会抑制重组蛋白的形成。丙酮酸脱羧酶是酿酒酵母代谢途径中的关键调节酶，其活性直接影响酿酒酵母发酵产物。因此在选育积累内酮酸的酿酒酵母工作中，为达到在酿酒酵母体内大量积累丙酮酸的目的，就必须切断或减弱丙酮酸进一步代
作者简介：高年发(1945-)，男，江苏吴江人，教授，研究方向为有机酸发醇。
保护作用。
3.2关于羧酸盐对酸性蛋白酶热稳定性的影响
酒石酸钾钠和醋酸钠于50℃条件下在所选的试验浓度范围内，均对酸性蛋白酶的热失活半寿期具有不同程度的延长，是酸性蛋白酶半寿期的2.4~11.0倍。其中酒石酸钾钠对酶半寿期的影响随其浓度的增加而增大，而醋酸钠浓度也并非越高越好，最适浓度需进一步实验确定。20mmol/L的酒石酸钾钠可将537酸性蛋白酶的半寿期延长11.0倍，具有非常显著的保护作用，而其他浓度的羧酸盐对该蛋白酶也有不同程度的保护作用。
3.3关于单糖和酸盐对蛋白酶保护作用的机理探讨
一般酶分子三维构象的改变就会导致酶的失活，而
氢键及疏水相互作用在维系酶分子三维构象的稳定性中起着至关重要的作用。经试验发现，对酸性蛋白酶起稳定作用的物质大多都有多个羟基或羧基，易形成氢键，但其形成氢键的能力比水要小，对酶分子内部氢键结构的破坏力也相对较弱。疏水相互作用在维系酶分子三维构象中也起到非常重要的作用，酶分子和溶剂间的疏水相互作用越强，酶分子就越稳定。多羟基和多羧基化合物易与水分
子形成氢键，在自已周围可诱导形成一个由氧键连接起来的水化层，增强了非极性基团之间的疏水相互作用，也使
得酶分子三维构象更加稳定。参考文献：
[1]获谨，孟文芳.生命的催化剂-酶工程[M]杭州：新江大学出版社， 2002.
[2] COLACO C, SEN S, THANGAVELU M, et al. Extrordinary stability of enzymes dried in trehalose: simplified molecular biology(), Nat Biotech no, 1992(10): 1007-1011.
[3] PAUL SD, FINN W, ROBERT BW, et al. Stabilization to Heat snd pro-tease degradation by complexing with antibody and by chemical modifi-cation[J]. Biochim Biopbys Acta, 1974, 350(2): 432.
[4] KELLIS JT, NYBERG K, Contributioe of bydrophobie interactions to protein stability[]. Nature, 1988, 333: 784-786.
[5] FONTANA A. Stracture and stability of thermophilic enzymes.Studies
on thermolysin[], Biophys Chem, 1998, 29(1-2): 181-193.[6]姜锡瑞.酶制剂应用手册[M]北京：中国轻工业出版社，1999]
[7] MALIKKIDES CO, WEILAND RH, On the thermal denaturation of glu-cose oxidasec[], Biotechnol Bloeng, 1982, 24(8): 1911-1914.