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2011 No. 4 Serial No. 229
China Brewing
耐高温酒精酵母诱变育种研究
王风芹，周丽娟，谢慧，宋安东*
（河南农业大学生命科学学院，河南郑州
1450002）
Research Report
要：以嗜释管囊酵母P01为出发菌株，经亚硝基胍诱变处理，采用TTC筛选平板初筛，杜氏管发酵二级筛选和混合糖发酵三级筛选，得摘
0000108
乙醇产率(9.5g/L)提高35.80%27.47%，30.81%。键，调：嗜棘管囊酵母；亚硝基肌；诱变；高温发醇关
中图分类号：TS261.1
文献标识码：A
文章编号：02545071(2011)04002802
Mutation breeding of thermostable alcohol producing yeast
WANG Fengqin, ZHOU Lijuan, XIE Hui, SONG Andong
(College of Life Science, Henan Agriculnural Uniersity, Zhengzhou 450002, China)
Abstract;Pachysolen tannophilas P-0I was used as starting strain for breeding thermostable sleohol prodacing yeast with nitrosoganidine (NTC) mutation. With the ordering screening with TTC plate, Durham tube fermentation and fermentation with mixed sugar (hexose and pentose), three mutant stains named as P-01-33, P-01-70 and P-01-190 were isolated. Yield of alcobol reached 12.9 g/L, 12.1 g/L and 13.3 g/L respect for the three strains at 38°C , which
were 35. 80% , 27.47% and 30. 81% higher than that of the starting strain P-01 (9.5g/L), respectively. Key words:Pachysolen tanophilas, nitrosoguanidine, mutation; high temperature fermentation
目前，世界各国经济发展都面临能源供应安全和生态环境保护的双重压力，为了实现能源、环境和经济的持续协调发展，各国都在致力于可再生能源的开发和研究(14]。燃料乙醇是可再生能源研究和应用的热点和重点之一，然而目前乙醇发酵的最适发酵温度为28℃~33℃，使得发酵过程中尤其是夏天需要消耗大量的能量用于发酵酵液的冷却。应用耐高温酒精酵母进行乙醇发酵可缩短发酵周期、提高设备利用率、提高出酒率、节省能源[3]。嗜管囊酵母（Pachysolentannophilus）P-01可以利用已糖和戊糖进行全糖发酵，此外，该菌株还具有易培养、易分离(下面酵母）、耐糠醛等有毒物质的优点，是纤维乙醇生产中极具应用潜力的菌株。本研究以亚硝基胍为诱变剂，对嗜联管囊酵母 P-01进行诱变育种，选育耐高温乙醇突变菌株，以期为工业生产提供宝贵的菌种资源。
1材料与方法 1.1苗种
嗜棘管囊酵母（Pachysolentannophilus）P-01，本实验室
保存菌株。 1.2 培养基
（1)活化培养基：木糖2g/100mL，酵母浸膏0.3g/100mL，蛋白陈0.5g/100mL。固体培养基加琼脂粉2g/100mL， pH5.0~5.5。
（2）混合糖发酵培养基：葡葡糖4g/100mL，木糖2g/100mL，酵母浸膏0.3g/100mL，蛋白陈0.5g/100mL，尿素0.02g/ 100mL，磷酸氢二铵0.01g/100mL，pH5.0~5.5。
来稿日期：2010-12-10
(3)TTC平板培养基：
上层：TTC0.05g/100mL，葡莓糖0.5g/100mL，琼脂1.5g/100mL：
下层：萄糖1.5g/100mL，木糖0.5g/100mL，蛋白陈 2g/100mL，酵母浸膏1g/100mL，琼脂2g/100mL，pH6.0~ 6.5。
1.3亚硝基胍(NTG)诱变
P-01接种于活化固体培养基斜面，30℃培养43h。挑取2~3环斜面菌种接种到50mL液体活化培养基中，30℃、 150r/min培养16h。取10mL菌液5000r/min离心10min，弃上清液。用10mL0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH7)悬浮菌体并离心洗涤2次，最后用10mL缓冲液悬浮菌体并加人 NTG（丙酮中含量为20mg/mL），避光处理1h后5000r/min 离心10min，菌体用缓冲液离心洗涤4次，并悬浮在相同体积的磷酸盐缓冲液中。将菌液进行系列稀释并涂布于活化
固体培养基上,38℃培养2d~3d[]。 1.4TTC平板初筛
亚硝基肌诱变后，在活化固体培养基上长势良好的菌落采用点种法接种到TTC下层平板，38℃培养至长出菌落，倒人10mL上层培养基，覆盖菌落，38℃避光保温2h~4h，
保存颜色较深的菌株1"]。 1.5杜氏管二级筛选
选择TTC平板显色反应中显色较深的菌株接种到液体活化培养基内进行2次活化(7}，然后按10%接种量接种到装有杜氏管的液体活化培养基试管中，38℃静置培养72h
基金项目：国家农业成果转化资金项目(2006GB2D000173）;2009年度河南省科技攻关重点项目（092102210110）作者简介：王风芹(1976－），女，副教授，研究方向为微生物能源工程；宋安东，教授，通信作者。