研究报告
中国酿造
木瓜蛋自酶无载体固定化研究张风态，杨洁，李利锋，李薇，朱启患*（山东大学威海分校海洋学院，山东威海264209）
2011年第7期总第232期
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法，固定化制备CLEA的方法以及游离木瓜蛋白酶和CLEA的应用条件、稳定性和不同离子对其活力的影响。结果表明，最适催化温度游离酶为65C，CLEA最适催化温度为75℃：游高酶收适催化pH值为6.6，CLEA最适催化pH值为7.6：米氏常数Km游高醇酶为1.25μmol/mL， CLEA为0.44μmo/mL，与游离木瓜蛋白酶相比，CLEA的米氏常数Km减小，具有耐高温、活性强、稳定性好等特征，能耐受一定pH值和温度变化，对金属离子不敏感。
关键词：木瓜蛋白酶：提取：固定化：交联酶聚体
中图分类号：Q814.2
文献标识码：A
文章编号：02545071(2011)07-0105-03
Carrier-free immobilization ofpapain
ZHANG Fengjie, YANG Jie, LI Lifeng, LI Wei, ZHU Qizhong
(Marine College at Weihai, Shandong University, Weihai 264209, China)
Abstract: Cross-linked enzyme aggregation (CLEA) is a novel carrier-free immobilization technique, In this study, the extraction and purification of free papain, the preparation of papain-CLEA and application conditions of CLEA, the stability and influence of different ions on the activity of fre papain were studied. The results showed that the optimal temperature, pH value and the Michaelis-constant (Km) for free papain catalysis were 65C, 6.6 value and 1.25μmol/mL, respectively. The optimal temperature, pH value and the Michaelis-constant (Km) for CLEA catalysis were 75°C, 7.6 and 0.44μmol/mL, respectively. The Km of CLEA was lower, and it could resist to high-temperature and had higher activity and good stability compared
with those of the free papain. In addition, it was not sensitive to pH value and temperature changes and metal ions Key words: papain; extraction; immobilization; cross-linked enzyme aggregation
木瓜蛋白酵(papain，PA)大量存在于番木瓜（Carica papaya)未成熟果实的乳汁中，是一种含殖基(-SH)的肽链内切酶。由于木瓜蛋白酶稳定性好，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等具有强的水解能力]。因而在食品、医药工业中有广泛的用途，还用于饲料、纺织及制革等领域。由于术瓜蛋白醛价格品贵且无法重复利用，促使人们研究和制备固定化木瓜蛋白酶。如何提高酶在工业过程中的稳定性是生物催化领域的中心议题。目前对木瓜蛋白酶较多采用载体固定方法主要有包埋法、吸附法、共价键结合法、交联法等，这些方法存在载酶量小、酶易泄漏等问题，并在操作步骤、固定率和固定化酶的各项性质方面有一定的缺陷。本实验研究了无载体固定化木瓜蛋白酶一—交联醇聚体(CLEA)图的方法以及温度、PH值、不同落剂和藏温度对游离酶和CLEA活性的影响，为该种无载体固定化酶的应用与开发提供相关科学依据。
1材料与方法 1.1材料和试剂
新鲜番木瓜（CaricapapayaL.）购自广西壮族自治区，木瓜蛋白酶试剂，50%戊二醛、半胱氨酸、EDTA-2Na、酪蛋白磷酸氢二钠、三氯醋酸、乙醇、冰醋酸、酪氨酸、三酮、乙酸钠、硫酸铵、氢氧化钠等均为分析纯。
收稿日期：2011-01-18
基金项目：山东大学威海分校SRTP立项作品(A10078)
1.2实验方法
1.2.1酶的提取和纯化
取番木瓜乳汁，加入保护剂，经硫酸铵和氟化钠多次
盐析、结晶、洗涤和干燥，得到木瓜蛋白醇。 1.2.2CLEA制备
制备木瓜蛋白酶CLEA参照王梦凡等的方法。称取 0.5g提取的瓜蛋白酶于试管中，加入7.5mL的pH值为7.0 磷酸氧二钠/磷酸二氢钠缓冲液使其溶解。另取10mL乙醇作沉淀剂逐滴加入上述试管中，边滴加边振荡试管。完全沉淀后以2000r/min转速离心，分离得沉淀物，向沉淀中滴加10mL50%的戊二醛交联剂，再次振荡令其混合均匀。于 4℃交联24h后以5000r/min转速离心，取沉淀物，先用蒸馏水洗涤3次，再用乙醇洗涤2次，最终分离得到沉淀。沉淀中残留乙醇完全挥发后于低温冻干，即制得木瓜蛋白酶CLEA。 1.2.3标准曲线测定
以不同浓度的酪氨酸作底物作波长595nm下处吸光度值曲线。
1.2.4酶活性测定
酶活性的测定参照罗远秀的方法。以酪蛋白为反应
底物，术瓜蛋白醇纯试剂和CLEA研磨后分别用含有 0.03mol/L半胱氮酸、0.006mol/LEDTA-2Na，pH4.5的酶稀
作害篇介：张风杰(1990-)，女，山东东平人，在读本科生，研究方向为酶工程学方面的研究和壳聚糖应用；朱启患*，教授，通讯作者。