第10卷第3期 2010年6月
过程工程学报
The Chinese Journal of Process Engineering
烟酸羟基化酶产生菌的快速筛选及催化条件
罗晖，箕春苗12，常雁红"，周北海？
(1.北京科技大学生物科学与技术系，北京100083：2.北京科技大学环境工程系，北京100083)
Vol.10 No.3 June 2010
摘要：建立了一种基于紫外显影法快速筛选烟酸羟基化酶产生菌的方法，用96孔板培养菌后，将菌液点样到滤纸 0 的最高酶活菌株BKC4进行了研究，菌株为杆状，革兰氏染色呈阴性，通过16SrRNA序列分析鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida).利用BKC4菌株催化烟酸合成6-羟基烟酸，结果表明，BKC4菌株烟酸羟基化酶的最适催化条
件为：底物浓度10g/L，温度37℃，pH6.5，摇床转速200r/min，酵在低于30℃C及pH6.0~6.5范围内较稳定，关键词：烟酸羟基化酶；紫外显影；烟酸：6-羟基烟酸
中图分类号：Q939 1前言
文献标识码：A
文章编号：1009-606X(2010)03-0576-06
光光度法筛选烟酸羟基化酶产生菌的方法，具有高通量筛选的特点
6-羟基烟酸，又名6-羟基-吡啶-3-甲酸，是一种重要的吡啶衍生物，是生产烟碱类杀虫农药的重要中间体，在医药、染料、材料等领域也有相当重要的地位["] 国内目前主要采用化学法生产6-羟基烟酸，副产物多、产量低、成本高、环境污染严重等诸多因素限制了其在工业上的应用：生物法生产6-羟基烟酸因过程简单、副产物少、环境污染少等优点越来越受到关注。利用烟酸羟基化酶可高效催化烟酸生成6-羟基烟酸，国外从20 世纪四、五十年代就开始了对烟酸羟基化酶产生菌的筛选[2)]，目前已对假单胞菌(Pseudomonas)3]、真杆菌(Eubacteriumbarkeri)4]、粘质沙雷氏菌株(Serratia marcescens)l31等的烟酸羟基化酶进行了研究，国内对利用微生物法生产6-羟基烟酸的研究起步较晚[1,6]，与国外的研究水平有较大差距，距工业化应用还有一些距离，因此筛选烟酸羟基化酶高产菌株对实现生物法生产 6-羟基烟酸具有现实意义，
产烟酸羟基化酶菌株的筛选主要是以烟酸为唯一碳源进行限制性培养，但培养出的菌株不一定产烟酸羟基化酶，还需对分离出的单菌落进行逐一检测[16]，使筛选工作具有随机性和盲目性，工作量大，且高活菌株筛选效率低.按此方法筛选出的Pseudomonassp.BK-1 菌株是目前国内报道的酶活最高的菌株，但其与国外报道的PseudomonasTN5(3和Serratiamarcescens IFO12648[3]菌株酶活相差较大.因此，为提高高酶活菌株的筛选概率，建立快速、方便的筛选方法十分必要。杨瑶等[7]建立了一种基于96孔板-酶标仪的双波长紫外分
针对以往产烟酸羟基化酶菌株的筛选方法需要使用复杂昂贵仪器并需对检测样品进行处理的不足，本研究根据烟酸羟基化酶的催化产物6-羟基烟酸在紫外光照射下显影的特性，建立了一种无需复茶贵重仪器的高通量菌株筛选方法，对利用该法筛选得到的高产菌株的烟酸羟基化酶的酶学特性及催化工艺进行研究，以期为生物法催化烟酸生产6-羟基烟酸的工业应用奠定基础
2实验 2.1分离土样
土样为山东、北京等地生产吡啶类结构物质的工厂
周围的土样。 2.2培养基
富集培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白陈10，烟酸10， NaCI 10. pH 7.0.
选择培养基(g/L)：
10,(NH4)SO42.0,
烟酸
MgSO7H,O 0.2,NaH2POH2O 0.5, CaCl2-H2O 0.5, K,HPO,0.5.pH7.0.
平板分离培养基(g/L)：酵母粉0.5,NaC110，烟酸 15，琼脂18.pH7.0.
种子培养基(g/L)：蛋白陈10，酵母粉5，烟酸10， NaCI 10, K,HPO, 1. pH 7.0.
产酶培养基(g/L)：蛋白陈10，酵母粉2，烟酸10， K,HPO4 1. pH 7.0.
斜面培养基(g/L)：蛋白陈10，酵母粉5，烟酸10 琼脂18.pH7.0.
收稿日期：2010-01-21，修回日期：2010-04-19
基金项目：国家重点基础研究发展规划(973)基金资助项目(编号：2007CB714304)
作奢简介：罗露(1975-)，男，江西省高安市人，博士，副教授，主要研究方向为酶工程，Tel:010-82377396,E-mail:buobui@ustb.edu.cn. 万方数据