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法测定胶原蛋白口服液中L一羟脯氨酸的含量
UV
张在国1高英2
（1、黑龙江生物科技职业学院，黑龙江哈尔滨1500002、黑龙江德顺长饮片有限公司，黑龙江哈尔滨150000）
商要：目的：建立UV法测定胶原蛋白口服液中L一羟随氨酸的含量方法。方法；样品经酸解释放L-羟崩氢酸，经氯胺T氧化，与二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物，在560mm处进行测定。结果：该方法在1.0640μg*mL-1~10.6400μg"mL-浓度范围内具有良好的线性关系，R=0.99999；平均回收率为99.89%,RSD(%)=0.10%。结论：该方法准确、可行，适用于较原蛋白口服液的质量控制方法。
关键词：胶原蛋白口服液：L一轻脯象酸；UV法
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胶原蛋白口服渡中主要功效成分为胶原蛋白中的L-羟脯氨酸，为保证产品质量选用L-羟脯氨酸为对照品采用紫外-可见分光光度法对胶原蛋白口服液中L-羟脯氨酸的含量进行测定,并对方法进行了专属性、线性、重复性、精密度、回收率等方面的方法学验证考紧。具体内容如下：
1仪器、试药与试剂的配制 1.1仪器与试药
紫外分光光度计(VARIAN);天平：感量为0.1mgL-羟脯氨酸对照品(中国药品生物制品检定所)实验样品(市售样品)。
1.2试剂的配制
1.2.1缓冲液的配制：醋酸钠140g.冰酷酸10ml,柠檬酸45g.用蒸馏水溶解并调节pH至6.0,定容至1L。(可冰箱内保存数月)。1.2.2氯胺T溶液的配制：称取氧胺T1.27，溶于20ml蒸溜水.加人正丙醇 30ml,和缓冲液40ml,混合均匀。(用时现配)。1.2.3对二甲氨基苯甲醛溶液的配制：称取二甲氨基苯甲醛30g加正丙醇至100ml。(用时现配)
2测定方法
2.1标准曲线的绘制：精密称取L-羟脯氨酸对照品适量,加水配制成浓度分别为1μg*mL-,3μg*mL-,5μg*mL-,7μg*mL-,10μg mL-"的对照品溶液。精密吸取对照品溶液2ml,加入氯胺T溶液3ml，加入高氯酸溶液3ml,混合，室温静置30min,加入二甲氨基苯甲醛溶液 3ml混合，水浴60%加热30min放冷。同时做试剂空白.在560nm处测定吸光度绘制标准曲线
2.2样品的测定：精密吸取样品溶液1ml加水稀释至50ml精密吸取上述溶液1ml,置10ml具塞试管中加4mol/L盐酸3ml,熔封后置 120℃烘箱中酸解6小时。酸解液用氢氧化钠调节pH至6.0,滤过，收集全部滤液用水定容至100ml。精密吸取上述处理液2ml,加入氯胺T 溶液3ml,加入高氯酸溶液3ml,混合，室温静置30min,加人二甲氨基苯甲醛溶液3ml,混合，水浴60℃加热30min,放冷。同时做试剂空白。在 560nm处测定吸光度，从标准曲线上计算出L-羟脯氨酸的浓度。
3检测波长的确定
取上述对照品溶液(5μg*mL-)和供试品溶液于500-700nm波长范围内扫描紫外扫描图见图1。从扫描图上可以看出对照品溶液在 556nm波长处有最大吸收，供试品溶液在557nm波长处有最大吸收. 参照文献,确定560nm为L-羟脯氨酸含量测定方法的检测波长。
4专属性试验
取空白样品1.0ml，按供试品溶液的制备项下方法操作，以相应的试剂为空白，于560mm波长处比色，测定吸收度。结果在560nm波长处无吸收，表明空白无千扰。
5线性关系考察
精密称取L-羟脯氨酸对照品10.64mg，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，再精密吸取1ml至100ml量瓶，加水稀释至刻度，作为对照品储备液。精密量取上述对照品储备液1、3.5、7ml，于10ml量瓶中，加水稀释至刻度。按标准曲线的绘制方法测定，以相应试剂为空白，于560mm波长处比色，测定吸收度。以浓度(C)为横坐标，吸收度(A)为纵坐标，进行线性回归，结果见表1。
回归方程为：Ahs=0.0965*C4E16
R=0.99999
结果表明，L-羟脯氨酸在1.0640~10.6400μg*mL-1浓度范围内，线性关系良好。
6重复性试验
取同一批次样品，按供试品溶液制备方法制备6份相同浓度的
供试品溶液，以相应的试剂为空白，于 560nm波长处比色，
测定吸收度。结果见表2。结果表明，重复性试验相对标准偏差小于1%，本法测定 L-羟脯氨酸含量重复性良好，可满足本品含量测定要求。
7回收率考察
精密称取L-羟脯氨酸对照品 13.62mg，置50ml 量瓶中，加空白样品溶液溶解并稀释至刻度。精密吸取上述对照品溶液0.8ml、 1.0ml,1.2ml, 置 10ml 具塞试管中，加 4mol/L盐酸3ml，熔封后置120℃烘箱中酸解2小时。酸解液用氢氧化钠调节pH至 6.0，滤过，收集全部滤液用水定容至100ml。精密吸取上述处理液 2ml,加入氯胺T溶液
8号量 (ed) ()
图1紫外扫描图表1线性关系测定结果
1 106e e
3,83 a3
1300 034
. TAO 67
表2重复性测定结果
台量 (ng+nd* 中市中中心
-
表3回收率测定结果
人量(+ ae
L4, e
干器款$% 8D% =5)
a
LaRRE
Re* (%)
量
27,6 2,g 2n,m r 2,m 2m,e
6,a 38
, n
r Teaz
a 38
8,
,,a
3ml，加人高氯酸溶液3ml，混合，室温静置30min，加入二甲氨基苯甲醛溶液3ml，混合，水浴60℃加热30min，放冷。同时做试剂空白，在 560nm处测定吸光度，从标准曲线上计算出L-羟脯氨酸的浓度，计算回收率。结果见表3。结果表明.各浓度下的平均回收率均在90。 110%之间，L-羟脯氢酸的回收率在90~110%之间，9个回收率数据的相对标准偏差小于1%，该方法准确可靠，误差在允许的范围内。
8结论
该测定方法准确、可行，适用于胶原蛋白口服液功效成分的含量测定。
9讨论
9.1采用紫外-可见分光光度法对胶原蛋白口服液中L-羟脯氨酸含量进行测定，方法重复性好，专属性强的优点，但需注意酸解时一定要熔封好，隔绝空气，否则120℃高温会使样品溶液挥干，导致试验失败。
9.2氧化剂氧胺T溶液不稳定，一定要临用新配。当氯胺T试药粉末白色变成微黄色时，说明氟胺T试药氧化了，停止使用。严格控
制测定方法中规定的温度。
参考文献
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[2]许亮,周荣清,石碧.酸法水解测定胶原中羟随氨酸含量条件的优化[J],皮革科学与工程,2005,15(5):2426