经验交流
中国酿造
酿酒酵母CHS3基因缺失对热耐受性的影响
刘向勇，张小华，王跃副
（滨州医学院药学院，山东烟合264003）
2010年第5期总第218期
·127.
摘要：研究真菌细胞壁几丁质合成酶CHS3基因在醇母热耐受性中的功能。采用长臂同源多聚酶链式反应(LFH-PCR)技术构建醇母CHS3基因缺失菌株；比较野生型与CHS3基因缺失菌株的儿丁质含量：梯度生长实验检测CHS3基因缺失南株的热敏感性。结果显示，与野生型菌株相比，CHS3基因缺失菌株表现出热胁迫敏感性表型，此表型可被抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)弥补，表明该热
敏感表型可能与热胁追条件下活性氧积累引发的氧化损伤。关键词：酿酒酵母：几丁质：基因敲除：CHS3：热胁迫
中图分类号：TS261.1
文献标识码：B
文章编号：0254-5071(2010)05-0127-02
EffectofdeletionofCHS3geneon thethermotoleranceinSaccharomyces cerevisiae
LIU Xiangyong, ZHANG Xiaohua, WANG Yuesi
(Department of Pharmacy, Binzhou Medical College, Yantai 264003, China)
Abstract: This paper was to investigate the role of chitin synthase gene CHS3 in yeast heat resistance. The CHS3 gene deletion mutant was construct-aseeooneoaooeo deletion mutant was investigated by spot dilution growth assays. The results showed that the CHS3 gene deletion mutant was more sensitive to the heat stress than the wild type, which could be restored by the addition of the antioxidant NAC. The increased heat sensitivity of CHS3 gene deletion
mutant may be caused by the accumulation of reactive oxygen species under beat stress condition, which can lead to oxidative damage. Key words; Saccharomyces cerevisiae, chitin; gene knockout; CHS3; beat stress
酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）是传统的工业生产菌株，广泛用于食品、医药及化工等发酵工业中。酿酒酵母对高温胁迫的耐受性是发酵工业特别是酒精发酵生产中的重要特性。酿酒酵母对高温胁迫的强耐受性可以显著降低后续酒精蒸增操作的能耗，提高设备利用率，缩短发酵周期。目前酵母耐热机制研究，主要集中热冲击蛋白(Heatshockprotein，HSP)、细胞抗氧化酶、生物多糖（海藻糖)等方面。有关酵母细胞重要组成部分细胞壁在细胞热耐受性中的功能研究尚未见报道。酵母细胞壁主要由葡聚糖（glucan）、几丁质（chitin）和甘露聚糖（mannan）等组成。几丁质文称甲壳素，是由N-乙酰-βB-D-氨基葡萄糖以 β-1，4糖苷键连接而成的高分子生物多聚体。几丁质合成是一个复杂的过程，酿酒酵母中存在3种几丁质合成酶基因（CHS1、CHS2、CHS3)，分别编码CSI、CS2和CS3，其中 CHS3基因位于酵母二号染色体上，全长3498bp，其编码的 CS3催化合成大多数的几丁质。
本实验采用长臂同源多聚酶链式反应(LFH-PCR)技术构建CHS3基因缺失菌株，并研究了该基因缺失对酵母热耐受性的影响，为进一步揭示酵母耐热机制和选育具有较高热耐受性酵母菌种奠定理论基础。
1材料与方法 1.1菌种和质粒
酿酒酵母LZ111 (MATa leu2-3/112 ura3-1 trp161 his3
收稿日期：2010-01-08
11/15ade2-1can1-100GALSUC2mal0)由日本酵母遗传中心提供。
1.2主要试剂和仅器
pfuDNA聚合酶、胶回收试剂盒：购自北京全式金公司：酵母粉、蛋白陈、鱼精DNA：购自上海生工公司；其他化学试剂均为国产分析纯。引物委托上海博亚公司合成。 1.3培养基
醇酵母用YEPD培养基：葡萄糖20g，蛋白陈10g，醇母粉 10g，加蒸馏水至1000mL，pH6.0~6.5，0.8MPa灭菌30min。
固体培养基添加2%(w/v)的琼脂。 1.4酵母基因组DNA的提取
取15mL的酵母过夜培养物，离心收集菌体，用0.5mL 无菌水悬浮，13000r/min离心30s，加200μL裂解缓冲液(2%(v/v) TritonX-100,1%(v/v) SDS,100mmol/LNaCl,10mmol/L Tris-CI(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0)）悬浮细胞，再加 200μL的玻璃珠和200μL的酚/氯仿，报荡3min，加200μL TE混匀，13000r/min离心5min，将上清液加1mL无水乙醇沉淀，13000r/min离心10min，干燥后加400μLTE，5μL10mg/mL RnaseA，37℃温育15min，加10μL4mol/L乙酸铵、1mL无水乙醇混匀后13000r/min离心10min，去上清液干燥，用 100μL的TE溶出。
1.5酵母完整细胞转化法
将过夜培养的菌转接至50mLYEPD中，使菌体浓度ODm
基金项目：国家自然科学基金(30801353)；山东省高等学校科技计划(J09LC08)：山东大学微生物技术国家重点实验室开放课题(M2008-14)；
滨州医学院科技计划(BY2007KJ1)：滨州医学院科研启动基金（(BY2008KYQD01）
作者简介：刘向勇（1981-)，男，山东滨州人，博士，研究方向微生物遗传与分子生物学，