研究报告
中国酿造
浓香型大曲中的嗜热真菌
董瑞丽"，罗惠波"2，叶光斌"2
2011年第4期总第229期
·75·
643000;2.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川自贡
(1.四川理工学院生物工程学院，四川
自责
643000）
要：试验通过分子生物学方法对浓香型大曲中真菌区系进行了研究。构建了真菌18SrRNA基因文库，并从文库中随机挑选85个阳性克隆子进行限制性片段长度多态性（RFLP)和测序比对分析，结果发现，克隆子编号D71、D46、D47的序列结果分别与Thermoascucrutaceus、 Thermomyoeslanuginosus和Talaromycesbyssochlamydoides的相似度达到99%，该结果表明浓香型大曲中存在很多以前末报道的嗜热真菌。
关键调：浓香型大曲；分子生物学；嗜热真菌
中图分类号：TS261.1
文献标识码：A
文章编号：0254=5071(2011)04007502
Thermophilic fungi in Luzhou flavor Daqu DONG Ruili', LUO Huibo'2, YE Guangbin'-?
(I. Department of Biological Engineering, Sichuan University of Science and Engineering, Zigong 643000; China; 2. Liquor Making Bio-Technology & Application of Key Laboratory of Sichuan Protince, Zigong 643000, China)
Abstract;Fungal community of Lazhou flavor Daqu wss investigated wsing molecular biological techniques. An 18S rRNA gene clone library was constructed and 85 positive clones were selocted randomly for further RFLP (restriction fragment length polymorphism) analysis and sequencing analysis. Clones D71 D46 and D47 had 99% similarity with Thermoascut crustacetus, Thermomyces lanuginosust and Talaromyces byssochlamydoides, respectively. The results
showed that some unreported thermophilie fungi existed in Luzhou lvor Daqu Keywords;Lazhou flavor Daqu; molecular biology; thermophilic fungi
自然界中的真菌大部分属于中温菌，在10℃~40℃的温度范围内生长旺盛。面嗜热真菌（thermophilicfungi）是一类最低生长温度为20℃或20℃以上，最高生长温度为 50℃或50℃以上的特殊真菌类群，因其在实验室常温条件下极少生长或不生长，而在高于常温范围内却可正常生长，所以不易被分离培养到，相对于其他真菌而言，研究较少，起步较晚。但随着人们对高温生命形式奥秘的揭示，嗜热微生物的研究也已成为国际研究的热门领域["]。
“曲为酒之骨”，大曲作为白酒发酵生产中的糖化剂、
发酵剂，含有多种微生物和多种酶类，大曲的类型与白酒的香型之间存在直接的关系。早期学者对大曲微生物研究表明，芽孢杆菌、需菌和醇母是大曲中的主要微生物(24)，但并未见到大曲中存在高温真菌的相关报道。近年来随着分子生物学的发展，一些新的技术如DGGE（DenaturingGradient Gel Electrophoresis）、基因文库,SSCP(Single-Strand Confor mationPolymorphism）等已经应用到白酒窖泥、精酪、大曲生物的相关研究当中(59]。
本试验迪过分子生物学手段对
于浓香型大曲中的真菌群落结构进行了相关研究，发现了很多高温真菌的存在，为浓香型大曲微生物的分离、应用提供了一些新的信息。
1材料与方法 1.1样品采集
州某大曲厂五月份生产的合格大曲粉碎混匀，采
收稿日期：201012-17
用”四分法”[10]得到所需试验所需样品量，并于-80℃ 存备用。
1.2样品中微生物总DNA提取
总DNA的提取使用的是土壤基因组DNA快速提取试剂盒（购自百克生物技术有限公司）。具体实验步骤参见产品说明书。
1.318SrDNA基因片段的PCR扩增
TATTAG-3*和EF3:5*-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3*进行真菌18SrDNA的基因扩增，以大曲中真菌总DNA为模板，可以扩增出约1500bp的片断[5,1]。PCR反应条件为预变性条件为95℃、3min94℃变性1min,52℃退火1min30s 和72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。 1.418S rDNA基因文库的构建
通过胶回收试剂盒纯化PCR产物，纯化后的产物连接到pMD19-TVector上，然后热激转化到E.coliDH5α感受态细胞中，涂布在LA固体平板上，37℃培养16h，随机挑取白色菌落，重新划线于LA平板中，以通用引物M13+（5' AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA-3')和 M13-(5'-CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC-3')为引物，菌落
PCR验证插人片段的大小，筛选阳性克隆。 1.5阳性克隆子PCR产物的RFLP图谱分析
将菌落PCR反应检测获得的阳性克隆子PCR产物，分
基金项目四川省年重大培育项目（N009ZZD15）；四川省科技厅2008年科技基础条件平台建设项目；酸酒生物技术及应用四川省重点实验室
开放基金项目（NJ2009-05）；泸州老窖科研奖学金项目(08ljzk03）资助
作者介：董瑞丽(1984-）女，在读硕士研究生，研究方向为发醇工程；罗惠波，，教授，通讯作者。