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2011 No.2 SerialNo.227
China Brewing
Research Report
康氏木霉纤维素酶CBHI基因克隆及在大肠杆菌中的表达黄时海"，康超，黄飞”，曹喜秀"，何鑫平1，汪晟'，吴孔阳"，曹普美"梁智群，李湘萍（1.广西大学生命科学与技术学院，广西南宁530005;2.广西大学动物紫殖研究所，广西南宁530005;
3.南宁新技术创业者中心，广西南宁530007)
摘要：将康氏木莓（Trichodemakoningi)总RNA反转录成cDNA第一链，并以之为模板进行RT-PCR，合成约1.5kb的纤维二糖水解酶1(cbhD基因。cbhI基因经测序确认后克降到表达载体pET-30a(+)上，PCR和双酶切鉴定筛选阳性重组子；将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS，并用0.4mmol/L的IPTG诱导表达重组蛋白。实验结果：cbhI基因在BL21(DE3)plysS中胞内融合表达，重组蛋白 pNPC酶活为15.6U/L，最适反应温度为45℃，最适pH值为5.0,Mn"对酶活力有明显的促进作用，SDS-PAGE表明重组蛋白分子量约为 70kDa
调：康氏木毒；纤维二糖水解酶I：cbhi基因；克隆表达关键
中图分类号：Q753
文献标识码：A
文章编号：0254-5071(2011)02007604
Cloning of CBHI gene of Trichoderma koningi cellulase and expression in Escherichia coli
HUANG Shihai', KANG Chao', HUANG Fei, CAO Xixiu', HE Xinping', WANG Sheng'
WU Kongyang', CAO Pumei ', LIANG Zhiqun', LI Xiangping*
(I.College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530005, Ching; 2.Animal Reproduction Institute, Guangxi
University, Nanning 530005, China; 3.Nanning New Technology Incubation Center, Nanning 530007, China)
Abstract: Cellobiase cbhl gene was cloned with RT-PCR by using Trichoderma Koningi cDNA as template. The cbhl gene was inserted directly into the temperature-inducible prokaryotic expression vector pET-30a(+)and transformed into E. coli BL21(DE3) plysS strain after sequence, When induced with 4mmol/L IPTG for 4h, the BL21 strain produced a recombinant cellobiobydrolase. The results indicated that gene cbh I could expressed in strain BL21 (DE3) plysS. Enzyme activity of pNPC was 15.6U/L under the conditions of temperature 45C and pH value 5.0. Ion Mn* significantly
improves the activity of the enzyme. Molecular weight of the recombinant cellobiohydrolase was about 70 kDa by the SDS-PAGE analysis. Key words: Trichoderma koningi; cellobiohydrolase l; gene cbhl; cloning and expression
纤维素是生物圈中最大的多聚体，是木质纤维中最基本的成分，也是贮存葡萄糖的一种重要形式。化石能源日益枯竭的今天，利用纤维素酶的降解作用进行纤维素的生物转化生产（如燃料酒精等）许多有用产品，不仅有利于环境保护，而且可有助于解决能源、根食、环境等一系列向题，具有广阔的应用前景和极大的经济价值"。虽然许多微生物都能合成纤维素酶，但产酶效率普遍较低，产酶能力和各种酶组分差异很大，质量不稳定，成为制约其在生物加工过程中广泛应用的瓶须。高效率、低成本生产实用纤维素酶已成为研究开发的热点和难点间。
纤维素酶由内切β-1,4葡聚糖酶(EG)，外切β-1,4葡
收稿日期：2010-10-14
聚糖酶(纤维二糖水解酶，CBH)和β-葡萄糖苷酶（纤维二糖酶，BG)组成。通过3种不同但又互补的酶协同作用，降解纤维素为葡萄糖等问。微生物产纤维素酶各种组分所占的比例主要由微生物内部的调控机制调节，而纤维素酶的不同应用过程往往对纤维素酶各组分的比例又有不同的要求，很难通过常规育种和改变培养条件等进行人为控制。此外，产酶能力普遍受其酶解产物葡萄糖的反馈抑制，即使选育得到抗阻遇菌株，酶活改善亦不明显。因此，克隆各种纤维素酶基因，将其构建到不受葡萄糖抑制的启动子下游，无反馈抑制，高效率高活力表达，继而将相对单一的各酶组分进行复配，满足不同生产领域的需要，是纤
基金项目：广西区教委人才项目（桂教人200962)：国家大学生创新基金（091059318)：广西大学实验教改项目(092301）作者简介：黄时海（1962-)，男，广西南宁人，高级工程师，研究方向为食品与发醇工程；李湘萍*，通讯作者。
6:21-24
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