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2017 Vol.36 No.3 Serial No.301
China Brewing
Research Report
枯草芽孢杆菌精氨酸脱羧酶基因speA的表达与蛋白纯化
曹宁王亚娟钟杰佟硕秋吴拥军。（贵州大学生命科学学院贵州贵阳550025）
摘要根据枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BJ3-2的精氨酸脱羧酶(ADC)的编码基因speA序列设计特异性醇切引物克隆基因speA 序列。测序结果显示基因speA全长为1473bp编码490个氨基酸分子质量为58ku。基因speA克隆至原核表达载体获得重组菌 pET28a-speA/BL21,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示1.0mmol/L的异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 28C诱导4h上清液和菌体均能表达出ADC蛋白上清液经纯化、透析、冷冻干燥可获得纯度97%的ADC酶酶联免疫吸附检测
(ELISA)ADC酶活为16780U/mg。为speA基因的表达、纯化及酶学性质研究奠定了理论基础关键词枯草芽孢杆菌精氨酸脱羧酶表达纯化
中图分类号.Q936
文章编号02545071(2017)03-0090-05
doi:10.11882/j.issn.02545071.2017.03.019
Expression andpurification of argininedecarboxylasegenespeA of Bacillussubtilis
CAO Ning, WANG Yajuan, ZHONG Jie, TONG Shuoqiu, WU Yongjun*(College of Life Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China)
Abstract Specific enzyme primers were designed according to the arginine decarboxylase (ADC) gene sequence of Bacillus subtilis BJ3-2, the genc speA was cloned and obtained. The results of sequence analysis indicated that the full-length of gene speA was 1 473 bp, which could encode 49 amino acids with deduced molecular mass of 58 ku. The gene speA was cloned into prokaryotic expression vector to obtain recombinant strain pET28a-speA/BL21. The results of SDS-PAGE showed that the target protein was induced with 1.0 mmol/L IPTG at 28 °C for 4 h, and the ADC protein could be expressed in supematant fluid and bacteria. After purification, dialysis and freeze-drying, the ADC with 97% purity was obtained in super natant fluid. The ADC activity was 16 780 U/mg by ELISA. The study laid a theoretical foundation for expression, purification and enzymatic proper-ties of gene speA
Key words Bacillus subtilis, arginine decarboxylase; expression; purification
生物胺(biogenicamineBA)是一类具有生物活性、低分子质量、含氮有机化合物的总称。根据组成成分可分为单胺酪略胺、组胺、户胺、本乙胺、色胺等）和多胺（腐胺、精胺和亚精胺)两大类"。生物胺可作为生物体合成荷尔蒙核酸、蛋目质的前体物质具有一定生理功能。但是过量摄人则会引起诸如头痛、恶心、心悸、血压变化、呼吸亲乱等过敏反应严重的还会危及生命()
生物胺的产生需具备游离的氨基酸和氨基酸脱羧酶通过氨基酸脱羧酶催化使氨基酸脱羧而产生。目前研究发现氨基酸脱羧酶主要存在于芽孢杆菌属、乳酸菌属、埃希氏杆菌属、变性菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属及一些柠檬酸细菌属细菌其中乳酸杆菌的催化脱接作用最为突出4
贵州地区水豆鼓属于典型的多菌混合细菌型自然发酵豆鼓主要参与发酵的微生物有芽孢杆菌属、枝芽孢杆菌属、产碱菌属、肠球菌属、丛毛单胞菌属、乳酸菌属和微球菌属等在这些微生物的发酵作用下形成风味独特的豆
收稿日期2016-12-20
基金项目国家自然科学基金项目（31260394/C200207）
鼓。实验室前期研究发现细菌型豆鼓能够有效分离出 8种生物胺分别是色胺、β-苯乙胺、腐胺、户胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺。其中前发酵阶段亚精胺含量最高精胺次之后发酵阶段酪胺含量最高且显著高于其他生物胺 2倍以上(]。在枯草芽孢杆菌中生物胺合成只有一条途径，起始于精氨酸在精氨酸脱羧酶、肌基胺酶、业精胺合酶和精胺合酶共同作用合成亚精胺或精胺)。精氨酸脱羧酶(argininedecarboxylaseADC)作为胺合成的关键酶(-例对精胺和亚精胺的形成起着重要的作用。所以目前认为控制食品中过量生物胺最有前景的方法是通过控制精氨酸脱羧酶的活性来控制生物胺的形成7。
枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis)是中国农业部批准使用的一种重要工业酶制剂的生产菌现已大量用于食品发酵行业。本实验室从水豆鼓样品中分离获得了B.subtilis BJ3-2菌株。本研究对B.subtilisBJ3-2菌株中获得的精氨酸脱羧酶(argininedecarboxylaseADC)基因speA序列进行聚合酶链反应(polymerasechainreactionPCR)扩增通过
作者简介曹宁(1989-）女士研究生研究方向为生物化学与分子生物学*通讯作者：吴拥军(1971-），男教授博士研究方向为食品生物技术
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