ICS 13.300; 11.100 A 80
GB
中华人民共和国国家标准
GB/T28647—2012
化学品 啮齿类动物子宫增重试验
雌激素作用的短期筛选试验
Chemicals-Test method of uterotrophic bioassay in rodents-
A short-term screeningtestfor oestrogenic properties
2012-12-01实施
2012-07-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
发布 GB/T28647--2012
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准技术性内容与经济合作与发展组织（OECD)化学品测试导则No.440(2007)《啮齿类动物子
宫增重试验雌激素作用的短期筛选试验》（英文版）一致。
本标准做了下列结构和编辑性修改：
-将OECD440原文中的“前言”和“最初考虑和局限性”部分内容作为本标准的“引言”；一增加了范围一章；将OECD440原文中的“附录1定义”部分内容作为本标准的“术语和定义”； -将OECD440原文中的“附录2OECD内分泌干扰物测定与评价的概念框架”部分内容作为
-
本标准的“附录A”。 本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。 本标准起草单位：中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所、辽宁省职业病防治院、中国化工
经济技术发展中心、中国检验检疫科学研究院。
本标准主要起草人：侯粉霞、曲波、王晓兵、李雪飞、白羽、李晞。 GB/T 28647—2012
引言
1998年，OECD启动了一项具有高度优先权的行动，即，修订现有指南、建立用于筛查和检测潜在内分泌干扰物的新指南。行动的内容之一就是建立啮齿类动物子宫增重试验的试验指南。之后，对啮齿类动物子宫增重试验开展了广泛的验证程序，包括详细的背景文件的编辑[2-3]以及通过应用强活性参比雌激素、弱活性雌激素受体激动剂、强活性雌激素受体拮抗剂、阴性参比化学物等作为受试物，开展广泛的实验室内和实验室间的比对来说明该试验的相关性和可重复性[4-9]。该试验指南440是在取了验证试验中的经验和参照了雌激素激动剂类受试物试验结果后形成的。
子宫增重试验是个始于20世纪30年代的短期筛选试验[27-28]，在1962年被一个专家委员会首次定为筛选试验[32.35]。它是基于子宫质量的增加或者子宫增重反应（参见5.3），用于评价一个化学物引起与天然雌激素（例如17β雌二醇，17β-estradiol)的激动剂或拮抗剂作用相一致的生物学作用的能力。 然而，该方法用于检测雌激素拮抗剂比用于检测雌激素激动剂要少得多。子宫对雌激素的反应方式有两种。最初的反应是吸收水分而引起子宫质量增加。此后，子宫组织增长进一步引起其质量增加[30]。 大鼠和小鼠的子宫反应具有可比性，
该试验是一项体内筛选试验，它的应用可参见“OECD内分泌干扰物测定与评价的概念框架”（附录A）。在这个概念框架中，子宫增重试验作为一项体内试验位于框架的第3级，阐明单一-种内分泌作用机制，即雌激素样作用。
子宫增重试验希望被纳人用于检测潜在内分泌干扰作用的系列体内和体外试验中，最终用于对人类健康和环境影响进行危险评价。OECD在开展该方法验证试验时，使用强活性和弱活性的雌激素激动剂来评估该试验检测雌激素样作用物质的效能[4-8]。因此，除了实验室内和实验室间良好的可重复性外，该试验用于检测雌激素样作用物质的敏感性也得到了很好的证实。
在该方法的验证试验中，仅使用了一种阴性参比物，有报道该种物质的子宫增重试验以及体外受体结合试验和受体检测试验为阴性。此外，也对验证试验之外的资料进行了评价，这些资料进-一步证明了子宫增重试验用于筛选雌激素样作用物质的特异性。
雌激素激动剂和拮抗剂作为雌激素α受体和β受体的配体，可分别活化或抑制受体的转录。这可引起潜在的健康危害，包括对生殖和发育产生影响。因此，需要快速地评价化学物是否有可能是雌激素激动剂或拮抗剂。虽然受试物与雌激素受体的亲和力、雌激素受体基因转录活化体外试验等方面的资料可提供信息，但这些信息仅是决定是否有可能产生有害作用的因素之一。其他的决定因素包括化学物进人体内后的代谢活化和失活、在各组织的分布情况、从体内清除的情况等；这些情况至少部分地依赖于染毒途径和被检测的受试物。这就需要了解受试物在体内环境中的活性，除非已有资料可说明该化学物的吸收一分布一代谢一排泄的特征。子宫组织在受到雌激素刺激后发生快速增长，特别是啮齿类实验动物（其发情周期持续约4d）。啮齿类动物，特别是大鼠，被广泛应用于危害评估的毒物学试验中。因此，啮齿类动物的子宫对于体内筛选雌激素激动剂和拮抗剂是一个适宜的靶器官。
本标准是基于那些在OECD验证试验中使用的试验方法，这些验证试验的结果已经表明该方法在实验室内和实验室间是可靠的和可重复的[5,门。现在可以利用两种方法，即切除卵巢的成年雌性动物方法（ovx-adultmethod）和未发育成熟的不切除卵巢的方法（immaturemethod）。OECD验证试验结果显示这两种方法有可比较的敏感性和可重复性。然而，对于未发育成熟的动物，因为其具备完整的下丘脑一垂体-一性腺（HPG)轴，用于试验时其反应的特异性要差一些，但却比切除卵巢的动物检测的范围更大一些，因为它除了可用于检测作用于雌激素受体的物质，也可用于检测作用于HPG轴的物质。 在大约为15日龄时，大鼠的HPG轴具有了功能。在这之前，用促性腺激素释放激素等处理不能促进
Ⅱ GB/T 28647—2012
青春期发育。在即将到达青春期、阴道开口之前，雌性动物将经历几个类似休眠的性周期，在这期间未引起阴道开口和排卵，但是激素水平会有波动。如果化学物直接或间接地刺激HGP轴，则可引起青春期提前、早排卵和加快阴道开口。除了可作用于HPG轴的物质外，若饲料中虽然不含有雌激素物质但含有较高水平的可代谢能量，也可刺激动物发育、加快阴道口开放。上述这些物质不会引起切除卵巢的成年动物的子宫增重反应，因为它们的HPG轴没有功能。
考患到动物福利，该方法应优先使用未发育成熟的大鼠，这样可以避免对动物做手术，也可避免由于动物进人发情周期而将动物废弃的可能性（见5.4.1）。
子宫增重不是完全由雌激素引起的，也就是说除了雌激素激动剂和拮抗剂之外的其他物质也可引起子宫增重。例如相对高剂量的黄体酮（progesterone）、睾酮或者各种人工合成的孕激素（progestin）都可刺激子宫增重[30]。子宫增重的任何改变可以通过组织学检查阴道角化而予以确定[30]。不管诱发因素是什么，如果子宫增重试验结果为阳性，则一般应进一步对其起因予以阐明。其他资料，如雌激素受体结合试验和雌激素受体转录活化试验等体外试验的资料以及雌性动物青春期分析等体内试验的资料，也可用于证明雌激素样作用。
由于子宫增重试验是作为一种体内筛选试验，因此，所开展的方法验证试验既要考虑动物福利的要求，又要考分阶段开展试验的策略。验证试验主要是为了充分证明其检测雌激素样作用（是许多化学物需要关注的方面的可重复性和敏感性，而对其检测抗雌激素样作用仅做了少量的验证工作。仅采用了一个强活性抗雌激素物质进行了验证，这是因为有明确的抗雌激素样作用（未受某些雌激素活性作用的干扰)资料的物质是很有限的。因此，本标准是针对雌激素样作用，而描述检测抗雌激素样作用的试验方法则包含在一个指南文件中。本方法用于检测单纯的抗雌激素物质的可重复性和敏感性在今后（当检测抗雌激素样作用的方法被常规使用了一段时间和使用本方法检测出了更多的抗雌激素样作用物质后）会有更清楚的描述。
众所周知，所有与动物有关的试验程序都应符合当地动物管理的标准；下面所述有关动物管理和处理的要求是最低标准，可被当地的动物管理要求所替代。OECD给出了仁慈对待动物的指南文件[25]。
与所有使用活体动物进行的试验一样，应在试验前确定是否需要开展该试验。例如在下列两种情况可开展该试验：（1)潜在的暴露量大（见附录A、概念框架中的第1级）、或者其雌激素样作用结果提示需通过开展体内试验来证明这种作用。（2)概念框架中第4级或第5级的体内试验结果提示需证实所产生的效应是与雌激素机制有关的，而体外试验不能对此予以证明。
目
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化学品 啮齿类动物子营增重试验
雌激素作用的短期筛选试验
1范围
本标准规定了化学品啮齿类动物子宫增重试验雌激素作用的短期筛选试验方法的术语和定义、试验原理、试验方法描述、试验步骤、试验数据和报告、结果的解释和认可。
本标准适用于雌激素作用短期筛选啮齿类动物子宫增重试验。
2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
2. 1
抗雌激素样作用 antioestrogenicity 化学品抑制哺乳动物体内17β-雌二醇（estradiol17β)作用的能力。
2. 2
出生日期 date of birth 出生后第0天。
2. 3
给药dosage 表示染毒剂量、染毒次数和染毒期限的一个总称。
2. 4
剂量dose 染毒受试物的量。对于子宫增重试验，剂量表示为实验动物每天每单位体重的受试物质量[如
mg/(kg·d)]。 2.5
最大耐受剂量 maximumtolerabledose,MTD 进人体内未引起实验动物死亡的受试物的最大量（用DL。表示）。
2. 6
雌激素样作用 oestrogenicity 化学品可在哺乳动物体内引起类似17β雌二醇（estradiol17β)作用的能力。
2.7
出生后x关 postnataldayx 出生日之后生活的第天。
2.8
敏感性 sensitivity 将阳性/有活性物质检测出阳性结果的比例。是对试验方法精确性（能正确检测出不同活性的物
质）的量度标准，而且是评价试验方法相关性时需认真考虑的方面。
1 GB/T28647—2012
2. 9
特异性specificity 将阴性/无活性物质检测出阴性结果的比例。是对试验方法精确性（能正确检测出不同活性的物
质)的量度标准，而且是评价试验方法相关性时需认真考虑的方面。 2. 10
子宫增重uterotrophic 描述对子宫组织增长的阳性影响。
2. 11
验证validation 一个科学过程，用于对一种试验方法的操作要求及其检测的局限性进行具体规定，并证明该试验方
法用于某种特定检测目的具有可靠性和相关性
3试验原理
3.1子宫增重试验的敏感性依赖于一种动物试验系统，即，动物的下丘脑-垂体-卵巢轴没有功能、导致很低的内源性雌激素水平，这样的试验系统可以保证子宫维持低质量以及雌激素染毒后动物的反应达到最大范围。雌性啮齿类动物有两种雌激素敏感状态可满足上述要求，即：
一断奶之后至青春期之前未发育成熟的雌性动物；一卵巢切除且在卵巢切除后经过了足够长的时间使子宫组织退化的初成年雌性动物。
3.2每日经口灌胃或皮下注射染毒受试物。至少设两个剂量组（见5.6.1），剂量应具有一定梯度，每组染毒一个剂量，若采用未成熟动物则其染毒期限为连续染毒3d；若采用切除卵巢的成年动物则其染毒期限为至少连续染毒3d。于末次染毒后约24h对动物进行大体解剖。对于雌激素激动剂，应评价染毒组的平均子宫质量与对照组相比是否有统计学意义的明显增高。如果染毒组动物的平均子宫质量明显增高，则说明该试验结果为阳性。
4试验方法描述
:
4.1动物种属的选择 4.1.1应使用常用的啮齿类动物品系，如本试验在验证时采用了SD大鼠和Wistar大鼠两个品系。 如果已知或怀疑某种品系动物子宫的反应性差，则不应使用这种品系的动物。实验室应说明所使用的动物品系的敏感性（见5.1）。 4.1.2子宫增重试验中一直常规使用大鼠和小鼠。OECD对本试验进行验证时仅使用了大鼠，这是因为OECD认为使用大鼠和小鼠可能不会有什么不同，为了节省资源和动物，国际范围内的验证试验使用一种品系的动物就足够了。大鼠是多数生殖和发育毒性试验的首选动物种属。考虑到小鼠有大量既往资料、扩大本试验中啮齿类动物的使用范围而使用小鼠，因此，随后用小鼠开展了一些验证试验[16]。为了与起初设定的节省资源和动物的目的相一致，验证试验采用了如下简化的办法：缩小了参与验证的化学物和实验室的数量、未使用编码样品进行实验。用这种简化方法进行的卵巢切除的初成年小鼠验证试验的结果，从定性和定量两方面说明了大鼠和小鼠的验证试验结果对应性很好。如果子宫增重试验是作为一个长期试验的预实验，则长期试验可选择使用与预实验相同的动物品系和动物来源。上述简化的方法仅限于切除卵巢的成年小鼠，未提供关于未成熟小鼠验证试验结果的资料，因此，
2
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在本标准的范围内不考虑使用未成熟小鼠进行试验。 4.1.3在有些情况下有可能使用小鼠而不使用大鼠。应依据毒理学、药代动力学和/或其他方面的资料说明使用小鼠的理由。使用小鼠时，也许需要对试验方法进行修改，例如由于小鼠单位体重的摄食量比大鼠多，因此小鼠饲料中植物雌激素的含量应比大鼠的低C9.20.22]。 4.2饲养条件， 4.2.1有关动物饲养的所有操作均应符合实验室所在地动物管理标准的要求。下面所述对动物管理和处理的要求仅是最低标准，如果当地有相关要求，也许应按照当地的动物管理要求。动物房温度应为 22℃土3℃，相对湿度最低为30%，最好不超过70%（清洁动物房时除外）。相对湿度的控制目标为在 50%～60%。采用人工照明，每日光照周期为明/暗各12h。 4.2.2动物应可自由摄食和饮水。初成年动物可单笼饲养或最多每笼3只群养。未发育成熟动物的年龄小，建议采用群养。 4.2.3已知饲料中高水平的植物雌激素能使啮齿类动物子宫质量增加到足以干扰子宫增重试验的结果[13-15]。如果使用未发育成熟的动物，饲料中高水平的植物雌激素和代谢产生的能量可使动物早熟。 饲料中的植物雌激素主要来源于饲料中的大豆和首猎成分，而且不同批次的饲料中植物雌激素的浓度也不同[23]。体重是一个重要的变量，因为摄食量与体重有关。因此，不同种属、不同年龄的动物从相同的饲料中所摄取的植物雌激素的剂量就可能不同9。对于未发育成熟的雌性大鼠，其单位体重摄食量大约是切除卵巢的初成年雌性大鼠的2倍。对于初成年的小鼠，其单位体重摄食量大约是切除卵巢的初成年雌性大鼠的4倍。 4.2.4子宫增重试验的结果显示，饲料中含有一定水平的植物雌激素是可接受的，不会降低该试验的敏感性9,17-19]。对于未发育成熟的SD和Wistar大鼠，可参考每克饲料中植物雌激素的水平应不超过 350μg染料木黄酮当量（genisteinequivalents）[s,9。这一参考同样适用于初成年切除卵巢的大鼠，因为其单位体重摄食量比未发育成熟的动物少。如果使用成年的切除卵巢的小鼠或使用对植物雌激素相对敏感的大鼠时，应按比例降低饲料中植物雌激素水平[20]。另外，不同饲料经代谢所产生能量多少的差异可导致青春期开始时间的改变[21-22]。 4.2.5试验前，应对饲料进行仔细选择以免由于饲料中植物雌激素水平高[6.9或代谢产生的能量高而影响试验结果[15,17,1922,36]。确保实验室所开展的试验可达到6.1.1和6.1.2中的要求是重要的。为了确保与良好实验室规范（Goodlaboratorypractice，GLP)要求相一致，应对试验中的每批饲料进行代表性抽样以便必要时分析其中植物雌激素的含量（例如当对照组子宫质量比历史对照值高时或对参比雌激素17α-乙炔基雌二醇产生了不适当的反应时）。抽取的样品应进行分析，或将其一20℃冷冻保存，或采取某种可防止样品在分析前分解的方式保存。 4.2.6某些垫料中可能含有天然雌激素或抗雌激素物质（如已知玉米芯做成的垫料可影响大鼠的性周期，表现为抗雌激素样作用）。选择的垫料中植物雌激素的水平应尽可能的低。 4.3动物的准备
将没有任何疾病和身体异常的动物随机分配到对照组和染毒组。应使由于笼具摆放位置而可能对动物产生影响最小化。动物应有唯一编号。对于未发育成熟动物，其在试验前观察期最好与母鼠或代哺母鼠同笼饲养至断奶。对于初成年动物以及与母鼠或代哺母鼠同笼饲养的未发育成熟动物，试验前观察期大约为5d，对于已经断奶无母鼠跟随的未发育成熟动物，也许有必要缩短试验前观察期，因为染毒应在断奶后马上开始（见5.3）。
3 GB/T 28647—2012
5试验步骤
5.1实验室能力验证 5.1.1可选择如下两种方式验证实验室的能力：
一一定期验证，这有赖于最初基准阳性对照试验（5.1.2)的情况。至少每6个月一次，而且每次应
有一个可能影响试验结果的改变（如饲料配方改变、进行子宫解剖的人员发生改变，动物品系或供应商发生改变等）；通过使用适当剂量（依据5.1.2）的参比雌激素：17α-乙炔基雌二醇（17α-ethinylestradiol，EE)（CAS：57-63-6）来验证试验系统（动物模型）的反应性。
一每个试验应同时设一个用合适剂量的参比雌激素染毒的对照组。 如果上述试验未得到预期结果，则应对试验条件做相应检查和修改。建议上述两种方式中使用的
参比雌激素的剂量约为效应剂量的70%80%。 5.1.2基准阳性对照试验：在首次开展本试验前，实验室应通过测试动物模型的反应性来证明其能力，至少设立4个剂量组用于建立对参比雌激素：17α-乙炔基雌二醇（17α-ethinylestradiol，EE）（CASNo. 57-63-6)产生反应的剂量效应关系。子宫质量增加的情况与已有的历史资料进行比较5]。如果该基准阳性对照试验未产生预期结果，则应对试验条件进行检查和修改。 5.2动物的数量和条件
各染毒组和对照组应至少包括6只动物（对未发育成熟动物和切除卵巢动物两个模型都适用）。 5.3未发育成熟的动物的年龄
对于未发育成熟动物的子宫增重试验，应记录每只动物的出生日期。应尽早开始染毒以确保在染毒结束后与青春期有关的内源性雌激素水平还没有增高。另一方面，有证据表明年龄太小的动物可能敏感性较差。为了确定动物的最佳年龄，每个实验室应从其历史资料中了解有关动物成熟日期方面的资料。
一般来说，大鼠的染毒可在出生后第18天早期断奶后立即开始。大鼠的染毒最好在出生后第21天完成，但最晚不可超过出生后的第25天，因为此后大鼠的下丘脑一垂体一卵巢轴开始出现功能，内源性雌激素水平可能开始增高，同时子宫质量均值及其标准差也增加[2-3.10-12]。 5.4卵巢切除术的程序 5.4.1对于切除卵巢的雌性大鼠和小鼠（染毒组和对照组），卵巢切除应在6周龄至8周龄进行。对于大鼠，卵巢切除与染毒首日之间最少要间隔14d以便使子宫退缩到最小、最稳定。对于小鼠，卵巢切除与染毒首日之间最少要间隔7d。由于少量的卵巢组织就足以引起明显的体内雌激素水平3}，因此，使用动物前应连续5d（例如卵巢切除后第10天至第14天)对动物进行阴道上皮涂片检查以检测动物的发情周期。如果证明某只动物进入了发情周期，则这只动物不能被用于试验。此外，解剖检查时，应注意检查是否存在残留的卵巢，有残留卵巢组织的动物不应计算在结果中[3]。 5.4.2进行卵巢切除时，采用一种适当的麻醉方法将动物麻醉后置于腹卧位。在腹腔后外侧壁切口，切口应为长度约1cm的纵向切口，其中点为肋下缘和骼骨顶部之间的中间点，横向距腰肌外侧缘几毫米。将卵巢从腹腔移至无菌环境。将卵巢与输卵管和子宫体分离。确认无大量出血后缝合腹壁，皮肤用夹子关闭切口或用适当的缝合线缝合。切除点在图1中有图示。应使用有经验的啮齿类动物兽医推荐的方法对动物进行术后镇痛处理。 4
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中华人民共和国国家标准
GB/T28647—2012
化学品 啮齿类动物子宫增重试验
雌激素作用的短期筛选试验
Chemicals-Test method of uterotrophic bioassay in rodents-
A short-term screeningtestfor oestrogenic properties
2012-12-01实施
2012-07-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
发布 GB/T28647--2012
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准技术性内容与经济合作与发展组织（OECD)化学品测试导则No.440(2007)《啮齿类动物子
宫增重试验雌激素作用的短期筛选试验》（英文版）一致。
本标准做了下列结构和编辑性修改：
-将OECD440原文中的“前言”和“最初考虑和局限性”部分内容作为本标准的“引言”；一增加了范围一章；将OECD440原文中的“附录1定义”部分内容作为本标准的“术语和定义”； -将OECD440原文中的“附录2OECD内分泌干扰物测定与评价的概念框架”部分内容作为
-
本标准的“附录A”。 本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。 本标准起草单位：中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所、辽宁省职业病防治院、中国化工
经济技术发展中心、中国检验检疫科学研究院。
本标准主要起草人：侯粉霞、曲波、王晓兵、李雪飞、白羽、李晞。 GB/T 28647—2012
引言
1998年，OECD启动了一项具有高度优先权的行动，即，修订现有指南、建立用于筛查和检测潜在内分泌干扰物的新指南。行动的内容之一就是建立啮齿类动物子宫增重试验的试验指南。之后，对啮齿类动物子宫增重试验开展了广泛的验证程序，包括详细的背景文件的编辑[2-3]以及通过应用强活性参比雌激素、弱活性雌激素受体激动剂、强活性雌激素受体拮抗剂、阴性参比化学物等作为受试物，开展广泛的实验室内和实验室间的比对来说明该试验的相关性和可重复性[4-9]。该试验指南440是在取了验证试验中的经验和参照了雌激素激动剂类受试物试验结果后形成的。
子宫增重试验是个始于20世纪30年代的短期筛选试验[27-28]，在1962年被一个专家委员会首次定为筛选试验[32.35]。它是基于子宫质量的增加或者子宫增重反应（参见5.3），用于评价一个化学物引起与天然雌激素（例如17β雌二醇，17β-estradiol)的激动剂或拮抗剂作用相一致的生物学作用的能力。 然而，该方法用于检测雌激素拮抗剂比用于检测雌激素激动剂要少得多。子宫对雌激素的反应方式有两种。最初的反应是吸收水分而引起子宫质量增加。此后，子宫组织增长进一步引起其质量增加[30]。 大鼠和小鼠的子宫反应具有可比性，
该试验是一项体内筛选试验，它的应用可参见“OECD内分泌干扰物测定与评价的概念框架”（附录A）。在这个概念框架中，子宫增重试验作为一项体内试验位于框架的第3级，阐明单一-种内分泌作用机制，即雌激素样作用。
子宫增重试验希望被纳人用于检测潜在内分泌干扰作用的系列体内和体外试验中，最终用于对人类健康和环境影响进行危险评价。OECD在开展该方法验证试验时，使用强活性和弱活性的雌激素激动剂来评估该试验检测雌激素样作用物质的效能[4-8]。因此，除了实验室内和实验室间良好的可重复性外，该试验用于检测雌激素样作用物质的敏感性也得到了很好的证实。
在该方法的验证试验中，仅使用了一种阴性参比物，有报道该种物质的子宫增重试验以及体外受体结合试验和受体检测试验为阴性。此外，也对验证试验之外的资料进行了评价，这些资料进-一步证明了子宫增重试验用于筛选雌激素样作用物质的特异性。
雌激素激动剂和拮抗剂作为雌激素α受体和β受体的配体，可分别活化或抑制受体的转录。这可引起潜在的健康危害，包括对生殖和发育产生影响。因此，需要快速地评价化学物是否有可能是雌激素激动剂或拮抗剂。虽然受试物与雌激素受体的亲和力、雌激素受体基因转录活化体外试验等方面的资料可提供信息，但这些信息仅是决定是否有可能产生有害作用的因素之一。其他的决定因素包括化学物进人体内后的代谢活化和失活、在各组织的分布情况、从体内清除的情况等；这些情况至少部分地依赖于染毒途径和被检测的受试物。这就需要了解受试物在体内环境中的活性，除非已有资料可说明该化学物的吸收一分布一代谢一排泄的特征。子宫组织在受到雌激素刺激后发生快速增长，特别是啮齿类实验动物（其发情周期持续约4d）。啮齿类动物，特别是大鼠，被广泛应用于危害评估的毒物学试验中。因此，啮齿类动物的子宫对于体内筛选雌激素激动剂和拮抗剂是一个适宜的靶器官。
本标准是基于那些在OECD验证试验中使用的试验方法，这些验证试验的结果已经表明该方法在实验室内和实验室间是可靠的和可重复的[5,门。现在可以利用两种方法，即切除卵巢的成年雌性动物方法（ovx-adultmethod）和未发育成熟的不切除卵巢的方法（immaturemethod）。OECD验证试验结果显示这两种方法有可比较的敏感性和可重复性。然而，对于未发育成熟的动物，因为其具备完整的下丘脑一垂体-一性腺（HPG)轴，用于试验时其反应的特异性要差一些，但却比切除卵巢的动物检测的范围更大一些，因为它除了可用于检测作用于雌激素受体的物质，也可用于检测作用于HPG轴的物质。 在大约为15日龄时，大鼠的HPG轴具有了功能。在这之前，用促性腺激素释放激素等处理不能促进
Ⅱ GB/T 28647—2012
青春期发育。在即将到达青春期、阴道开口之前，雌性动物将经历几个类似休眠的性周期，在这期间未引起阴道开口和排卵，但是激素水平会有波动。如果化学物直接或间接地刺激HGP轴，则可引起青春期提前、早排卵和加快阴道开口。除了可作用于HPG轴的物质外，若饲料中虽然不含有雌激素物质但含有较高水平的可代谢能量，也可刺激动物发育、加快阴道口开放。上述这些物质不会引起切除卵巢的成年动物的子宫增重反应，因为它们的HPG轴没有功能。
考患到动物福利，该方法应优先使用未发育成熟的大鼠，这样可以避免对动物做手术，也可避免由于动物进人发情周期而将动物废弃的可能性（见5.4.1）。
子宫增重不是完全由雌激素引起的，也就是说除了雌激素激动剂和拮抗剂之外的其他物质也可引起子宫增重。例如相对高剂量的黄体酮（progesterone）、睾酮或者各种人工合成的孕激素（progestin）都可刺激子宫增重[30]。子宫增重的任何改变可以通过组织学检查阴道角化而予以确定[30]。不管诱发因素是什么，如果子宫增重试验结果为阳性，则一般应进一步对其起因予以阐明。其他资料，如雌激素受体结合试验和雌激素受体转录活化试验等体外试验的资料以及雌性动物青春期分析等体内试验的资料，也可用于证明雌激素样作用。
由于子宫增重试验是作为一种体内筛选试验，因此，所开展的方法验证试验既要考虑动物福利的要求，又要考分阶段开展试验的策略。验证试验主要是为了充分证明其检测雌激素样作用（是许多化学物需要关注的方面的可重复性和敏感性，而对其检测抗雌激素样作用仅做了少量的验证工作。仅采用了一个强活性抗雌激素物质进行了验证，这是因为有明确的抗雌激素样作用（未受某些雌激素活性作用的干扰)资料的物质是很有限的。因此，本标准是针对雌激素样作用，而描述检测抗雌激素样作用的试验方法则包含在一个指南文件中。本方法用于检测单纯的抗雌激素物质的可重复性和敏感性在今后（当检测抗雌激素样作用的方法被常规使用了一段时间和使用本方法检测出了更多的抗雌激素样作用物质后）会有更清楚的描述。
众所周知，所有与动物有关的试验程序都应符合当地动物管理的标准；下面所述有关动物管理和处理的要求是最低标准，可被当地的动物管理要求所替代。OECD给出了仁慈对待动物的指南文件[25]。
与所有使用活体动物进行的试验一样，应在试验前确定是否需要开展该试验。例如在下列两种情况可开展该试验：（1)潜在的暴露量大（见附录A、概念框架中的第1级）、或者其雌激素样作用结果提示需通过开展体内试验来证明这种作用。（2)概念框架中第4级或第5级的体内试验结果提示需证实所产生的效应是与雌激素机制有关的，而体外试验不能对此予以证明。
目
龙牛网www.longniu.com下载 GB/T28647—2012
化学品 啮齿类动物子营增重试验
雌激素作用的短期筛选试验
1范围
本标准规定了化学品啮齿类动物子宫增重试验雌激素作用的短期筛选试验方法的术语和定义、试验原理、试验方法描述、试验步骤、试验数据和报告、结果的解释和认可。
本标准适用于雌激素作用短期筛选啮齿类动物子宫增重试验。
2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
2. 1
抗雌激素样作用 antioestrogenicity 化学品抑制哺乳动物体内17β-雌二醇（estradiol17β)作用的能力。
2. 2
出生日期 date of birth 出生后第0天。
2. 3
给药dosage 表示染毒剂量、染毒次数和染毒期限的一个总称。
2. 4
剂量dose 染毒受试物的量。对于子宫增重试验，剂量表示为实验动物每天每单位体重的受试物质量[如
mg/(kg·d)]。 2.5
最大耐受剂量 maximumtolerabledose,MTD 进人体内未引起实验动物死亡的受试物的最大量（用DL。表示）。
2. 6
雌激素样作用 oestrogenicity 化学品可在哺乳动物体内引起类似17β雌二醇（estradiol17β)作用的能力。
2.7
出生后x关 postnataldayx 出生日之后生活的第天。
2.8
敏感性 sensitivity 将阳性/有活性物质检测出阳性结果的比例。是对试验方法精确性（能正确检测出不同活性的物
质）的量度标准，而且是评价试验方法相关性时需认真考虑的方面。
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2. 9
特异性specificity 将阴性/无活性物质检测出阴性结果的比例。是对试验方法精确性（能正确检测出不同活性的物
质)的量度标准，而且是评价试验方法相关性时需认真考虑的方面。 2. 10
子宫增重uterotrophic 描述对子宫组织增长的阳性影响。
2. 11
验证validation 一个科学过程，用于对一种试验方法的操作要求及其检测的局限性进行具体规定，并证明该试验方
法用于某种特定检测目的具有可靠性和相关性
3试验原理
3.1子宫增重试验的敏感性依赖于一种动物试验系统，即，动物的下丘脑-垂体-卵巢轴没有功能、导致很低的内源性雌激素水平，这样的试验系统可以保证子宫维持低质量以及雌激素染毒后动物的反应达到最大范围。雌性啮齿类动物有两种雌激素敏感状态可满足上述要求，即：
一断奶之后至青春期之前未发育成熟的雌性动物；一卵巢切除且在卵巢切除后经过了足够长的时间使子宫组织退化的初成年雌性动物。
3.2每日经口灌胃或皮下注射染毒受试物。至少设两个剂量组（见5.6.1），剂量应具有一定梯度，每组染毒一个剂量，若采用未成熟动物则其染毒期限为连续染毒3d；若采用切除卵巢的成年动物则其染毒期限为至少连续染毒3d。于末次染毒后约24h对动物进行大体解剖。对于雌激素激动剂，应评价染毒组的平均子宫质量与对照组相比是否有统计学意义的明显增高。如果染毒组动物的平均子宫质量明显增高，则说明该试验结果为阳性。
4试验方法描述
:
4.1动物种属的选择 4.1.1应使用常用的啮齿类动物品系，如本试验在验证时采用了SD大鼠和Wistar大鼠两个品系。 如果已知或怀疑某种品系动物子宫的反应性差，则不应使用这种品系的动物。实验室应说明所使用的动物品系的敏感性（见5.1）。 4.1.2子宫增重试验中一直常规使用大鼠和小鼠。OECD对本试验进行验证时仅使用了大鼠，这是因为OECD认为使用大鼠和小鼠可能不会有什么不同，为了节省资源和动物，国际范围内的验证试验使用一种品系的动物就足够了。大鼠是多数生殖和发育毒性试验的首选动物种属。考虑到小鼠有大量既往资料、扩大本试验中啮齿类动物的使用范围而使用小鼠，因此，随后用小鼠开展了一些验证试验[16]。为了与起初设定的节省资源和动物的目的相一致，验证试验采用了如下简化的办法：缩小了参与验证的化学物和实验室的数量、未使用编码样品进行实验。用这种简化方法进行的卵巢切除的初成年小鼠验证试验的结果，从定性和定量两方面说明了大鼠和小鼠的验证试验结果对应性很好。如果子宫增重试验是作为一个长期试验的预实验，则长期试验可选择使用与预实验相同的动物品系和动物来源。上述简化的方法仅限于切除卵巢的成年小鼠，未提供关于未成熟小鼠验证试验结果的资料，因此，
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在本标准的范围内不考虑使用未成熟小鼠进行试验。 4.1.3在有些情况下有可能使用小鼠而不使用大鼠。应依据毒理学、药代动力学和/或其他方面的资料说明使用小鼠的理由。使用小鼠时，也许需要对试验方法进行修改，例如由于小鼠单位体重的摄食量比大鼠多，因此小鼠饲料中植物雌激素的含量应比大鼠的低C9.20.22]。 4.2饲养条件， 4.2.1有关动物饲养的所有操作均应符合实验室所在地动物管理标准的要求。下面所述对动物管理和处理的要求仅是最低标准，如果当地有相关要求，也许应按照当地的动物管理要求。动物房温度应为 22℃土3℃，相对湿度最低为30%，最好不超过70%（清洁动物房时除外）。相对湿度的控制目标为在 50%～60%。采用人工照明，每日光照周期为明/暗各12h。 4.2.2动物应可自由摄食和饮水。初成年动物可单笼饲养或最多每笼3只群养。未发育成熟动物的年龄小，建议采用群养。 4.2.3已知饲料中高水平的植物雌激素能使啮齿类动物子宫质量增加到足以干扰子宫增重试验的结果[13-15]。如果使用未发育成熟的动物，饲料中高水平的植物雌激素和代谢产生的能量可使动物早熟。 饲料中的植物雌激素主要来源于饲料中的大豆和首猎成分，而且不同批次的饲料中植物雌激素的浓度也不同[23]。体重是一个重要的变量，因为摄食量与体重有关。因此，不同种属、不同年龄的动物从相同的饲料中所摄取的植物雌激素的剂量就可能不同9。对于未发育成熟的雌性大鼠，其单位体重摄食量大约是切除卵巢的初成年雌性大鼠的2倍。对于初成年的小鼠，其单位体重摄食量大约是切除卵巢的初成年雌性大鼠的4倍。 4.2.4子宫增重试验的结果显示，饲料中含有一定水平的植物雌激素是可接受的，不会降低该试验的敏感性9,17-19]。对于未发育成熟的SD和Wistar大鼠，可参考每克饲料中植物雌激素的水平应不超过 350μg染料木黄酮当量（genisteinequivalents）[s,9。这一参考同样适用于初成年切除卵巢的大鼠，因为其单位体重摄食量比未发育成熟的动物少。如果使用成年的切除卵巢的小鼠或使用对植物雌激素相对敏感的大鼠时，应按比例降低饲料中植物雌激素水平[20]。另外，不同饲料经代谢所产生能量多少的差异可导致青春期开始时间的改变[21-22]。 4.2.5试验前，应对饲料进行仔细选择以免由于饲料中植物雌激素水平高[6.9或代谢产生的能量高而影响试验结果[15,17,1922,36]。确保实验室所开展的试验可达到6.1.1和6.1.2中的要求是重要的。为了确保与良好实验室规范（Goodlaboratorypractice，GLP)要求相一致，应对试验中的每批饲料进行代表性抽样以便必要时分析其中植物雌激素的含量（例如当对照组子宫质量比历史对照值高时或对参比雌激素17α-乙炔基雌二醇产生了不适当的反应时）。抽取的样品应进行分析，或将其一20℃冷冻保存，或采取某种可防止样品在分析前分解的方式保存。 4.2.6某些垫料中可能含有天然雌激素或抗雌激素物质（如已知玉米芯做成的垫料可影响大鼠的性周期，表现为抗雌激素样作用）。选择的垫料中植物雌激素的水平应尽可能的低。 4.3动物的准备
将没有任何疾病和身体异常的动物随机分配到对照组和染毒组。应使由于笼具摆放位置而可能对动物产生影响最小化。动物应有唯一编号。对于未发育成熟动物，其在试验前观察期最好与母鼠或代哺母鼠同笼饲养至断奶。对于初成年动物以及与母鼠或代哺母鼠同笼饲养的未发育成熟动物，试验前观察期大约为5d，对于已经断奶无母鼠跟随的未发育成熟动物，也许有必要缩短试验前观察期，因为染毒应在断奶后马上开始（见5.3）。
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5试验步骤
5.1实验室能力验证 5.1.1可选择如下两种方式验证实验室的能力：
一一定期验证，这有赖于最初基准阳性对照试验（5.1.2)的情况。至少每6个月一次，而且每次应
有一个可能影响试验结果的改变（如饲料配方改变、进行子宫解剖的人员发生改变，动物品系或供应商发生改变等）；通过使用适当剂量（依据5.1.2）的参比雌激素：17α-乙炔基雌二醇（17α-ethinylestradiol，EE)（CAS：57-63-6）来验证试验系统（动物模型）的反应性。
一每个试验应同时设一个用合适剂量的参比雌激素染毒的对照组。 如果上述试验未得到预期结果，则应对试验条件做相应检查和修改。建议上述两种方式中使用的
参比雌激素的剂量约为效应剂量的70%80%。 5.1.2基准阳性对照试验：在首次开展本试验前，实验室应通过测试动物模型的反应性来证明其能力，至少设立4个剂量组用于建立对参比雌激素：17α-乙炔基雌二醇（17α-ethinylestradiol，EE）（CASNo. 57-63-6)产生反应的剂量效应关系。子宫质量增加的情况与已有的历史资料进行比较5]。如果该基准阳性对照试验未产生预期结果，则应对试验条件进行检查和修改。 5.2动物的数量和条件
各染毒组和对照组应至少包括6只动物（对未发育成熟动物和切除卵巢动物两个模型都适用）。 5.3未发育成熟的动物的年龄
对于未发育成熟动物的子宫增重试验，应记录每只动物的出生日期。应尽早开始染毒以确保在染毒结束后与青春期有关的内源性雌激素水平还没有增高。另一方面，有证据表明年龄太小的动物可能敏感性较差。为了确定动物的最佳年龄，每个实验室应从其历史资料中了解有关动物成熟日期方面的资料。
一般来说，大鼠的染毒可在出生后第18天早期断奶后立即开始。大鼠的染毒最好在出生后第21天完成，但最晚不可超过出生后的第25天，因为此后大鼠的下丘脑一垂体一卵巢轴开始出现功能，内源性雌激素水平可能开始增高，同时子宫质量均值及其标准差也增加[2-3.10-12]。 5.4卵巢切除术的程序 5.4.1对于切除卵巢的雌性大鼠和小鼠（染毒组和对照组），卵巢切除应在6周龄至8周龄进行。对于大鼠，卵巢切除与染毒首日之间最少要间隔14d以便使子宫退缩到最小、最稳定。对于小鼠，卵巢切除与染毒首日之间最少要间隔7d。由于少量的卵巢组织就足以引起明显的体内雌激素水平3}，因此，使用动物前应连续5d（例如卵巢切除后第10天至第14天)对动物进行阴道上皮涂片检查以检测动物的发情周期。如果证明某只动物进入了发情周期，则这只动物不能被用于试验。此外，解剖检查时，应注意检查是否存在残留的卵巢，有残留卵巢组织的动物不应计算在结果中[3]。 5.4.2进行卵巢切除时，采用一种适当的麻醉方法将动物麻醉后置于腹卧位。在腹腔后外侧壁切口，切口应为长度约1cm的纵向切口，其中点为肋下缘和骼骨顶部之间的中间点，横向距腰肌外侧缘几毫米。将卵巢从腹腔移至无菌环境。将卵巢与输卵管和子宫体分离。确认无大量出血后缝合腹壁，皮肤用夹子关闭切口或用适当的缝合线缝合。切除点在图1中有图示。应使用有经验的啮齿类动物兽医推荐的方法对动物进行术后镇痛处理。 4
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