ICS 13.300;13.020.40 A 80
GB
中华人民共和国国家标准
GB/T355152017
化学品 鱼类雌激素、雄激素和芳香酶
抑制活性试验方法
ChemicalsFish assay for oestrogenic and androgenic activity
and aromatase inhibition
2017-12-29发布
2018-07-01实施
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
中国国家标准化管理委员会 发布 GB/T35515—2017
目 次
前言引言
ⅡI
范围术语、定义和缩略语， 3 方法概述
2
质量保证与质量控制仪器设备
4
5 6 试验准备
6.1 试验用水 6.2 鱼的驯养 6.3 预暴露和鱼的选择试验程序 7.1 一般说明 7.2 试验浓度的选择 8试验过程 8.1 受试鱼的选择与称重 8.2 暴露条件
7
8.2.1 时间 8.2.2 驯养 8.2.3 灯光和温度 8.3 测试频率 8.4 观察 8.4.1 死亡率 8.4.2 行为和表观 8.4.3 鱼的安乐死 8.4.4 第二性征的观察 8.4.5 卵黄蛋白原测定数据和报告 9.1采用方差分析（ANOVA)对生物标志物响应进行评价 9.2 试验结果报告附录A（资料性附录） 进行卵黄蛋白原分析的样品收集推荐程序附录B（资料性附录） 检测特定内分泌活性物质对黑头呆鱼和青鳞的第二性征的评估附录C（资料性附录） 鱼类内分泌筛选试验的实验条件附录D（资料性附录） 斑马鱼和黑头呆鱼的产卵基板附录E（资料性附录） 可接受的稀释水的一些化学特性
16
21
23
25 GB/T35515—2017
附录F（资料性附录） 卵黄蛋白原加标和批间标准品分析附录G（资料性附录） 统计分析流程附录H（规范性附录） 试验结果阐释和可接受性的标准参考文献
26
27 28
图A.1 用剪刀沿着胸鳍前剪开图A.2 用剪刀沿着腹部中线伸入腹部离肛门头部大约2mm处图A.3 采用手术钳撑开腹壁，暴露肝脏以及其他内部器官（或者将腹壁横向固定）图A.4 采用手术钳缓慢分离和切除肝脏图A.5 采用手术钳缓慢摘取肠道图A.6 肠道以及任何肠系膜的附属物的终端采用剪刀切割图A.7 （雌鱼)对于雌鱼过程相同图A.8 完成整个过程图A.9 斑马鱼鱼头鱼尾的切分图 B.1 黑头呆鱼珠星的数目和尺寸图 B.2 臀鳍形状和尺寸的性别差异图 B.3 臀鳍线的结合板上的突起过程图 B.4 带有切割点的鱼身照片图 D.1 斑马鱼产卵基板图 D.2 黑头呆鱼产卵基板图 G.1 统计分析流程图
10 10
11 11
12 15 17 19 20 20 23 24 27
表B.1 黑头呆鱼珠星模板表 C.1 鱼类内分泌筛选试验的实验条件表E.1 可接受的稀释水的一些化学特性
18 21 2.5 GB/T 35515—2017
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准技术内容与经济合作与发展组织（OrganizationforEconomicCooperationandDevelopment，
OECD)测试导则230(2009年）《21d鱼试验：雌激素、雄激素和芳香酶抑制活性短期筛选试验》（英文版）一致。
本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、广东省微生物分析检测中心、上海市检测中心、宁波出
入境检验检疫局。
本标准主要起草人：崔媛、陈会明、曾国驱、李海山、谢文平、梅承芳、殷浩文、梁艺怀、陈小青。
= GB/T35515—2017
引言
本试验方法描述了一种体内筛选试验方法，将性成熟的雄鱼和处于产卵期的雌鱼一起暴露于化学品中21d。在21d暴露期结束时，对雄鱼和雌鱼的生物标志物终点进行测定，作为测试化学品的雌激素、芳香酶抑制或雄激素活性指标。这些测试终点包括卵黄蛋白原和第二性征。对黑头呆鱼、日本青和斑马鱼可进行卵黄蛋白原测定，而第二性征只能在黑头呆鱼和日本青上测定
卵黄蛋白原通常受循环的内源性睢激素的刺激，由雌性卵生脊椎动物的肝脏产生。卵黄蛋白原是
卵黄蛋白的前体，一旦在肝脏中产生，由血流进入卵巢，被发育中的卵吸收并修饰。卵黄蛋白原在未成熟的雌鱼和雄鱼的血浆中几乎检测不到，因为它们缺乏足够的循环雌激素，但在受外源性的雌激素的刺激下，肝脏能够合成并分泌卵黄蛋白原，
卵黄蛋白原的测定能够检测不同雌激素作用模式的化学品，对雌激素类化学品的检测，有可能通过
测量雄鱼的卵黄蛋白原的产生。在雌性体内的雌激素循环水平的降低，例如通过抑制转化内源性雄激素为天然雌激素173-雌二醇的芳香酶，会引起卵黄蛋白原水平的降低，这一点被用来检测具有芳香酶抑制性质的化学品，
采用已建立标准化的常规检测方法。采用免疫化学的物种特异性的酶联免疫吸收分析（ELISA)方法，收集黑头呆鱼的血液、斑马鱼的血液或头/尾的匀浆以及青的肝脏，作为VTG测定的样品。对于青鳞，在血液中测量的VTG与肝脏中所测具有良好的相关性。附录A提供了对于卵黄蛋白原分析的样品收集的推荐程序。卵黄蛋白原可采用不同的试验方法，但都得基于验证的物种特异性ELISA 方法。
特定物种雄鱼的第二性征是可观察的，与内源性雄激素循环水平呈定量响应性，这些特性在黑头呆鱼和青上能体现，但斑马鱼没有体现，因为斑马鱼不具备可定量的第二性征
对于黑头呆鱼，外源受试物暴露的主要指标是位于雌鱼唇部珠星的数量。对于青，乳突物的数目组成了雌鱼的外源性暴露于雄激素受试物的主要标志物。附录B分别说明了对于黑头呆鱼和青的性特征评价的过程。
IV GB/T35515—2017
化学品 鱼类雌激素、雄激素和芳香酶
抑制活性试验方法
1范围
本标准规定了化学品鱼类雌激素、雄激素和芳香酶抑制活性试验方法的方法概述、质量保证与质量控制、仪器设备、试验准备、试验程序、试验过程、数据和报告。
本标准适用于化学品鱼类激素、雄激素和芳香酶抑制活性试验。
术语、定义和缩略语
2
2.12 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
2.1.1
承载率loadingrate 单位体积水中鱼的湿重。
2.1.2
承载密度 stockingdensity 单位体积水中鱼的数目。
2.1.3
卵黄蛋白原 vitellogenin;VTG 一种磷脂糖蛋白，蛋黄蛋白的前体，一般出现于所有卵生动物的性成熟雌性个体。
2.1.4
最大耐受浓度 maximumtolerated concentration:MTC 受试物引起小于10%死亡率的最高试验浓度，
2.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。 ELISA：酶联免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassay）
3方法概述
将处于繁殖期的雌鱼和雄鱼共同暴露于受试物中。根据所选受试鱼物种对其相关生物标志物终点指标进行测定。其中性特征可在解剖后目测确认，其他生物测试指标参见附录C的表C.1。设置3个受试物浓度以及一个空白对照，必要时可采用溶剂对照。对于青鳞和斑马鱼，每个受试浓度至少有2个试验容器（每个试验容器中包括5尾雄鱼和5尾雌鱼）；对于黑头呆鱼，每个受试浓度至少有4个试验容器（每个试验容器中包括2尾雄鱼和4尾雌鱼）。暴露进行21d，在第21天暴露时对鱼进行取样。
在第21天取样时，所有动物处以安乐死。对于黑头呆鱼和青进行第二性征检测，参见附录B；取斑马鱼和黑头呆鱼血液样本，或者取斑马鱼的头/尾组织匀浆样本检测卵黄蛋白原，参见附录A；对于青
1 ICS 13.300;13.020.40 A 80
GB
中华人民共和国国家标准
GB/T355152017
化学品 鱼类雌激素、雄激素和芳香酶
抑制活性试验方法
ChemicalsFish assay for oestrogenic and androgenic activity
and aromatase inhibition
2017-12-29发布
2018-07-01实施
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
中国国家标准化管理委员会 发布 GB/T35515—2017
目 次
前言引言
ⅡI
范围术语、定义和缩略语， 3 方法概述
2
质量保证与质量控制仪器设备
4
5 6 试验准备
6.1 试验用水 6.2 鱼的驯养 6.3 预暴露和鱼的选择试验程序 7.1 一般说明 7.2 试验浓度的选择 8试验过程 8.1 受试鱼的选择与称重 8.2 暴露条件
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8.2.1 时间 8.2.2 驯养 8.2.3 灯光和温度 8.3 测试频率 8.4 观察 8.4.1 死亡率 8.4.2 行为和表观 8.4.3 鱼的安乐死 8.4.4 第二性征的观察 8.4.5 卵黄蛋白原测定数据和报告 9.1采用方差分析（ANOVA)对生物标志物响应进行评价 9.2 试验结果报告附录A（资料性附录） 进行卵黄蛋白原分析的样品收集推荐程序附录B（资料性附录） 检测特定内分泌活性物质对黑头呆鱼和青鳞的第二性征的评估附录C（资料性附录） 鱼类内分泌筛选试验的实验条件附录D（资料性附录） 斑马鱼和黑头呆鱼的产卵基板附录E（资料性附录） 可接受的稀释水的一些化学特性
16
21
23
25 GB/T35515—2017
附录F（资料性附录） 卵黄蛋白原加标和批间标准品分析附录G（资料性附录） 统计分析流程附录H（规范性附录） 试验结果阐释和可接受性的标准参考文献
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图A.1 用剪刀沿着胸鳍前剪开图A.2 用剪刀沿着腹部中线伸入腹部离肛门头部大约2mm处图A.3 采用手术钳撑开腹壁，暴露肝脏以及其他内部器官（或者将腹壁横向固定）图A.4 采用手术钳缓慢分离和切除肝脏图A.5 采用手术钳缓慢摘取肠道图A.6 肠道以及任何肠系膜的附属物的终端采用剪刀切割图A.7 （雌鱼)对于雌鱼过程相同图A.8 完成整个过程图A.9 斑马鱼鱼头鱼尾的切分图 B.1 黑头呆鱼珠星的数目和尺寸图 B.2 臀鳍形状和尺寸的性别差异图 B.3 臀鳍线的结合板上的突起过程图 B.4 带有切割点的鱼身照片图 D.1 斑马鱼产卵基板图 D.2 黑头呆鱼产卵基板图 G.1 统计分析流程图
10 10
11 11
12 15 17 19 20 20 23 24 27
表B.1 黑头呆鱼珠星模板表 C.1 鱼类内分泌筛选试验的实验条件表E.1 可接受的稀释水的一些化学特性
18 21 2.5 GB/T 35515—2017
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准技术内容与经济合作与发展组织（OrganizationforEconomicCooperationandDevelopment，
OECD)测试导则230(2009年）《21d鱼试验：雌激素、雄激素和芳香酶抑制活性短期筛选试验》（英文版）一致。
本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、广东省微生物分析检测中心、上海市检测中心、宁波出
入境检验检疫局。
本标准主要起草人：崔媛、陈会明、曾国驱、李海山、谢文平、梅承芳、殷浩文、梁艺怀、陈小青。
= GB/T35515—2017
引言
本试验方法描述了一种体内筛选试验方法，将性成熟的雄鱼和处于产卵期的雌鱼一起暴露于化学品中21d。在21d暴露期结束时，对雄鱼和雌鱼的生物标志物终点进行测定，作为测试化学品的雌激素、芳香酶抑制或雄激素活性指标。这些测试终点包括卵黄蛋白原和第二性征。对黑头呆鱼、日本青和斑马鱼可进行卵黄蛋白原测定，而第二性征只能在黑头呆鱼和日本青上测定
卵黄蛋白原通常受循环的内源性睢激素的刺激，由雌性卵生脊椎动物的肝脏产生。卵黄蛋白原是
卵黄蛋白的前体，一旦在肝脏中产生，由血流进入卵巢，被发育中的卵吸收并修饰。卵黄蛋白原在未成熟的雌鱼和雄鱼的血浆中几乎检测不到，因为它们缺乏足够的循环雌激素，但在受外源性的雌激素的刺激下，肝脏能够合成并分泌卵黄蛋白原，
卵黄蛋白原的测定能够检测不同雌激素作用模式的化学品，对雌激素类化学品的检测，有可能通过
测量雄鱼的卵黄蛋白原的产生。在雌性体内的雌激素循环水平的降低，例如通过抑制转化内源性雄激素为天然雌激素173-雌二醇的芳香酶，会引起卵黄蛋白原水平的降低，这一点被用来检测具有芳香酶抑制性质的化学品，
采用已建立标准化的常规检测方法。采用免疫化学的物种特异性的酶联免疫吸收分析（ELISA)方法，收集黑头呆鱼的血液、斑马鱼的血液或头/尾的匀浆以及青的肝脏，作为VTG测定的样品。对于青鳞，在血液中测量的VTG与肝脏中所测具有良好的相关性。附录A提供了对于卵黄蛋白原分析的样品收集的推荐程序。卵黄蛋白原可采用不同的试验方法，但都得基于验证的物种特异性ELISA 方法。
特定物种雄鱼的第二性征是可观察的，与内源性雄激素循环水平呈定量响应性，这些特性在黑头呆鱼和青上能体现，但斑马鱼没有体现，因为斑马鱼不具备可定量的第二性征
对于黑头呆鱼，外源受试物暴露的主要指标是位于雌鱼唇部珠星的数量。对于青，乳突物的数目组成了雌鱼的外源性暴露于雄激素受试物的主要标志物。附录B分别说明了对于黑头呆鱼和青的性特征评价的过程。
IV GB/T35515—2017
化学品 鱼类雌激素、雄激素和芳香酶
抑制活性试验方法
1范围
本标准规定了化学品鱼类雌激素、雄激素和芳香酶抑制活性试验方法的方法概述、质量保证与质量控制、仪器设备、试验准备、试验程序、试验过程、数据和报告。
本标准适用于化学品鱼类激素、雄激素和芳香酶抑制活性试验。
术语、定义和缩略语
2
2.12 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
2.1.1
承载率loadingrate 单位体积水中鱼的湿重。
2.1.2
承载密度 stockingdensity 单位体积水中鱼的数目。
2.1.3
卵黄蛋白原 vitellogenin;VTG 一种磷脂糖蛋白，蛋黄蛋白的前体，一般出现于所有卵生动物的性成熟雌性个体。
2.1.4
最大耐受浓度 maximumtolerated concentration:MTC 受试物引起小于10%死亡率的最高试验浓度，
2.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。 ELISA：酶联免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassay）
3方法概述
将处于繁殖期的雌鱼和雄鱼共同暴露于受试物中。根据所选受试鱼物种对其相关生物标志物终点指标进行测定。其中性特征可在解剖后目测确认，其他生物测试指标参见附录C的表C.1。设置3个受试物浓度以及一个空白对照，必要时可采用溶剂对照。对于青鳞和斑马鱼，每个受试浓度至少有2个试验容器（每个试验容器中包括5尾雄鱼和5尾雌鱼）；对于黑头呆鱼，每个受试浓度至少有4个试验容器（每个试验容器中包括2尾雄鱼和4尾雌鱼）。暴露进行21d，在第21天暴露时对鱼进行取样。
在第21天取样时，所有动物处以安乐死。对于黑头呆鱼和青进行第二性征检测，参见附录B；取斑马鱼和黑头呆鱼血液样本，或者取斑马鱼的头/尾组织匀浆样本检测卵黄蛋白原，参见附录A；对于青
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