ICS 13.300;11.100 A 80
GB
中华人民共和国国家标准
GB/T35519—2017
化学品 稳定转染人雌激素受体转录活性试验 雌激素激动活性法
ChemicalsStablytransfected human estrogen receptor transcriptional
activationassayDetectionof estrogenic agonistsactivation
2018-07-01实施
2017-12-29发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
中国国家标准化管理委员会 发布 中华人民共 和 国
国家标准
化学品稳定转染人雌激素受体转录活性试验 雌激素激动活性法
GB/T35519—2017
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中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029) 北京市西城区三里河北街16号（100045）
网址：www.spc.org.cn 服务热线：400-168-0010 2017年12月第一版
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书号：155066·1-58318
版权专有 侵权必究 GB/T 35519—2017
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准与经济合作与发展组织（OECD）化学品测试方法No.455《Performance-BasedTest
Guideline for Stably Transfected Transactivation In Vitro Assays to Detect Estrogen Receptor Ago- nists》（2012）技术性内容一致
本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、复旦大学。 本标准主要起草人：陈相、缪文彬、陈青、陈会明、张静、朱洪坤、赵颐晴、蒋伟、姚丽芳、清江、邬春华。
一 GB/T 35519—2017
引言
本标准描述利用稳定转染的细胞系检测雌激素受体激动剂的体外转录激活试验方法，包括原理和功能相似的雌激素受体（Estrogenreceptor，ERs）激动剂，旨在促进类似的或者经改进的检测方法符合经济合作与发展组织关于危害评估新方法的验证和认可的指导规范，
本标准附录A和附录B已经经过验证。附录A为利用稳定转染人ERα的hERα-HeLa-9903细胞系检测化学品雌激素活性的转录激活试验，附录B为利用能够表达人ERα的BG1Luc-4E2细胞进行的雌激素受体转录激活试验。本标准的雌激素受体转录激活试验方法可以在各国间使用，有利于数据互认。
1998年经济合作与发展组织发起优先项目活动，旨在对现行指导原则进行修订，同时为筛选和测定潜在的内分泌干扰物制定新的指导原则。经济合作与发展组织的测定、评估潜在内分泌干扰物质的概念框架于2012年修订。概念框架由5个阶段组成，不同阶段对应生物复杂性的不同阶段。本标准是第二阶段的“体外试验，提供内分泌作用机制/通路信息”。本标准是鉴定雌激素受体激动剂的体外转录激活试验方法。
Ⅱ GB/T35519—2017
化学品 品稳定转染人雌激素受体转录活性试验 雌激素激动活性法
1范围
本标准规定了利用稳定转染细胞系检测雌激素受体激动剂的试验的术语和定义、试验原理、试验方法与步骤、数据和报告。
本标准适用于利用稳定转染细胞系检测雌激素受体激动剂的试验评估化学品类雌激素的生物活性。
术语、定义和缩略语
2
2.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。 2.1.1
激动剂agonist 与特定受体结合时能产生某种反应（如转录)的物质。
2.1.2
拮抗剂 antagonist 与受体结合后自身不能引起生物反应，但能阻断或抑制激动剂介导的反应的一类受体的配体或化
学品。 2.1.3
抗雌激素活性 anti-estrogenic activity 种化学品抑制17β-雌二醇介导的雌激素受体作用的能力。
2.1.4
活性炭/葡聚糖处理 charcoal/dextran treatment 细胞培养中的血浆处理方法，可以去除内源性激素和激素结合蛋白。
2.1.5
细胞毒性 cytotoxicity 与平行的溶剂对照组相比，对细胞结构或功能产生毒害并最终导致细胞死亡的毒性效应，表现为毒
物暴露后细胞数量减少或细胞功能减弱。 2.1.6
雌激素活性 estrogenic activity 化学品模拟17β-雌二醇结合和激活雌激素受体的能力。
2.1.7
性能标准 performance standard 评估一种试验方法在机制和功能方面是否与验证方法一致的标准。包括：
基本的试验方法；在验证方法中用来证明试验方法可行的最少的对照化学品清单：
一
1 GB/T35519—2017
以验证试验为标准，测试试验通过对照品验证其准确性和可靠性的水平
2.1.8
稳定转染 stable transfection 当DNA被转染到培养的细胞后，整合到细胞基因中，稳定的表达所转染的基因，形成的细胞克隆
用稳定标志物进行筛选（如G418抗性）。 2.1.9
转录激活 transactivation;TA 响应特定化学信号（如雌激素与雌激素受体结合信号）的信使核糖核酸合成。
2.1.10
弱阳性对照 weak positive control 对照品中阳性反应较弱的化学品，用于确保试验的准确性，
2.1.11
溶剂对照 vehicle control; VC 溶剂单独作为对照。
2.1.12
验收标准 accceptability criteria 符合试验控制和参考标准的最低标准。
2.1.13
准确性 accuracy 试验结果与公认参考值的接近程度，衡量试验方法的效能和相关性。
2.1.14
熟练度 proficiency 检测未知化学品前能正确使用试验方法的能力。
2.1.15
参考标准 reference standard 用于证明试验方法合适的对照品。
2.2 缩略语
本标准所用缩略语见表1。
表1 缩略语
中文全称
英文全称
缩略语 STTA E2 ER RLU HeLa BG-1 DMSO hERa
稳定转染转录激活试验 17β-雌二醇雌激素受体相对光单位 -种永生的人宫颈细胞系种能内源性表达雌激素受体 An immortalized adenocarcinoma cell that endogenously express 永生腺癌细胞
Stably TransfectedTransactivation assay 17β-estradiol Estrogen Receptor Relative Light Units An immortal human cervical cell line
estrogen receptor Dimethyl sulfoxide Human estrogen receptor alpha
二甲基亚矾人雌激素受体α
2 GB/T35519—2017
表1（续）
缩略语 hERβ RPMI1640 DNA
中文全称
英文全称
Human estrogen receptor beta
人雌激素受体β 洛斯维帕克研究所研发的一类培养基，培养基代号1640 脱氧核糖核酸
Roswell park memorial institute 1640
deoxyribonucleic acid
3试验原理
3.1 基于效能的试验指导原则中试验方法原理
3.1.1雌激素与受体的相互作用调控基因转录，诱导和阻滞细胞的复制，影响细胞增殖、胎儿发育和生殖功能。干扰正常的雌激素系统会对机体的生殖发育产生不良影响， 3.1.2化学品与特异受体直接或间接作用调节报告基因的转录。转录激活试验广泛用于评估受特定核受体(如雌激素受体)调控的特定基因表达，用于受雌激素受体调控的雌激素转录激活的检测。雌激素受体（EstrogenReceptor，ER)至少存在两种亚型，即α和β亚型，由完全不同的基因编码，具有不同的组织分布、配体相对结合力和生物学功能。受体ERα只是对经典的雌激素反应进行调节，目前正在研发的模型主要是测定与ERα有关的ER活性。试验原理是化学品与配体结合后激活ER，然后受体配体复合物结合到脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA)反应元件，转录激活报告基因，使细胞中标志蛋白表达增加。有两种不同的报告反应：在荧光素酶系统里荧光素酶使荧光素底物转变成生物荧光产物，用光度计定量检测；利用荧光蛋白和LacZ基因，LacZ基因能编码β-半乳糖，将无色底物X-gal （5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）转化成蓝色产物，用光度计检测。
3.2试验的使用范围和局限性 3.2.1本方法是体外检测化学品结合ERs引发的转录激活活性，因此试验结果不能直接推演到体内有复杂信号和调控机制的正常内分泌系统。 3.2.2雌激素受体介导的转录激活是内分泌紊乱的主要机制之一，还有一些其他的内分泌干扰机制，包括：
与内分泌系统中其他受体和酶作用；激素合成；激素的代谢激活和/或失活；
-
一靶组织激素的分布；
机体中激素的清除。
3.2.3本方法描述了化学品激活（如激动剂）而不是抑制（如拮抗剂）ER依赖的转录能力。因此，试验结果为阴性的化学品应在进行了ER结合试验或在检测ER抗剂的试验之后，才能得出化学品不能结合ER的结论。
4试验方法与步骤
4.1方法
本方法是一种适用于由一个或多个雌激素反应元件调控的使用稳定转染/内源性ERα受体和稳定
3 GB/T35519—2017
转染报告基因的方法，但是也适用于其他的雌激素受体如ERβ。 4.2对照
应确定参照雌激素和对照物。合适的对照（阴性、溶剂和阳性对照），确认试验是否在同等的试验条件下进行。 4.3质量控制规程
标准质量控制规程应能确保细胞系稳定传代，无支原体污染及对雌激素反应良好。细胞系应保证
其良好的特性和不受污染（如真菌、酵母菌核病毒）。 4.4 实验室操作熟练程度验证
按照本方法检测未知化学品前，每个实验室应能熟练地检测已知的标准品，以确保试验系统良好。 4.5验收标准的测试运行
所有的验收标准应确保试验的有效性。测试的接受与否取决于每个试验的参照雌激素和对照品的
检测结果。参照雌激素的PC50或EC5o应符合选择的试验的验收标准（稳定转染激活试验见附录A， BG1Luc雌激素受体转录激活试验见附录B)，以及所有的阳性和阴性对照在试验中应有正确的分类。 多个实验室参照雌激素曲线拟合参数平均值的标准差或变异系数可以用于验证实验室间的重复性。还应符合以下验收标准：
应有足够的数据以定量评估ER激活作用（效果和效力）：一参照雌激素的参考浓度的平均反应活度不能小于测试方法中溶剂对照的最小特异倍数（对于
稳定转染激活试验和BG1Luc雌激素受体转录激活试验，最小特异倍数为4)，以保证试验的敏感性；化学品浓度应在可溶性范围且不能产生细胞毒性
注1：PC即所引起的响应水平等于同板的阳性对照物（1nmol/L17β-雌二醇)诱导的响应水平%的受试物浓度注2：ECso即激动剂引起基线（底部)和最大响应（顶部)之间一半时的浓度。
5数据和报告
5.1 数据分析
试验数据可用于阳性和阴性反应分类。试验系统的使用应符合验收标准，但是即便符合验收标准也不能确保试验得到正确的数据。重复试验才是保证数据可靠性的最好方法，如果试验数据一致（如两次试验都判断化学品为阳性），不用重复第三次。如两次试验结果不一致（如一次判断为阳性，一次为阴性），或者需更大的把握，则应重复第三次。 5.2数据分析标准
本试验方法的结果还没有统一的分析方法，但是ER激活能力的定性（如阳性/阴性）或定量（如 EC5o和PC5o）分析应在科学的数据分析方法下进行，在条件允许的情况下，阳性结果应同时依据反应强度（与溶剂对照和参照雌激素比)和反应浓度（如EC50、PCs0、受试物诱导的最大反应水平等）判断。 5.3试验报告
试验报告应包括下列信息： a）受试物： 4