ICS 13.060.70 G 76 备案号：34608—2012
HG
中华人民共和国化工行业标准
HG/T 4207—2011
工业循环冷却水异养菌菌数测定
平血计数法
Examination of heterotrophic bacteria in industrial circulating
cooling waterstandard of plate count
2012-07-01实施
2011-12-20发布
中华人民共和国工业和信息化部 发布 HG/T 4207—2011
前 言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中国石油和化学工业联合会提出。 本标准由全国化学标准化技术委员会水处理剂分技术委员会（SAC/TC63/SC5)归口。 本标准由中海油天津化工研究设计院、深圳市华测检测技术股份有限公司、上海未来企业有限公
司、天津正达科技有限责任公司负责起草。
本标准主要起草人：张全、郭勇、刘昕、朱传俊、邵宏谦，
I HG/T4207—2011
工业循环冷却水异养菌菌数测定 平血计数法
1范围
本标准规定了工业循环冷却水异养菌菌数的测定方法。 本标准适用于工业循环冷却水中异养菌菌数的测定，也适用于原水、生活用水及其他水中异养菌菌
数的测定。 2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备（negGB/T603—2002，ISO6353-1： 1982)
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（modGB/T6682—2008，ISO3696：1987)） 3方法提要
本方法采用平血计数法，将待测水样用10倍稀释法稀释至需要的稀释度，用移液管将不同稀释度试样1mL分别接种到无菌培养皿中，将冷却至（45±1）℃灭菌后的培养基10mL～15mL灌人培养皿内，混合均匀。待固化后置于（29士1）℃生化培养箱中培养72h，培养期满后按照计数方法进行计数。 4试剂和材料 4.1 牛肉膏(生物试剂）。 4. 2 蛋白陈（生物试剂）。 4.3 琼脂(生物试剂)。 4.4 氢氧化钠溶液（40g/L）。 4.5 乙醇溶液[75%（体积分数)]。 4. 6 氯化钠。 4.7 牛皮纸。 4.8 医用脱脂棉。 4.9 医用脱脂纱布。 4. 10 硫代硫酸钠。 5 ：仪器、设备 5. 1 常规微生物实验设备。 5.2无菌箱（室）或超净工作台。 5.3 蒸汽压力灭菌锅。 5.4 生化培养箱：（0～50）℃士1℃。 5.5电热干燥箱：温度可控制在（60～280）℃士2℃。 5.6玻璃培养皿或一次性灭菌塑料培养皿：d90mm。 5.7刻度吸管：1mL。 5.8 刻度吸管：10mL。
1 HG/T4207—2011 5.9试管（做盐水管用）d20mm×200mm。 5.10磨口试剂瓶：1000mL。 5.11糖瓷量杯：1000mL。 5.12锥形瓶：500mL。 6实验前的准备 6.1培养基的制备 6.1.1称取下列试剂：牛肉膏3.0g，蛋白陈10.0g，氯化钠5.0g，琼脂15g～20g。 6.1.2将上述试剂加水约950mL，在电炉上加热溶解后，趁热用四层医用脱脂纱布过滤于塘瓷量杯中，用热水补充至1000mL，用氢氧化钠溶液调节pH值至7.2～7.4，并分装在500mL锥形瓶中，每瓶分装量不超过其容积的三分之二。塞上棉塞，用牛皮纸把瓶口包好，用蒸汽压力灭菌锅于（121土1）℃ 灭菌15min~30min。
注：亦可直接购买市售的营养琼脂作为培养基。 6.2无菌稀释水的制备 6.2.1生理盐水的配制：称取8.5g氯化钠，溶解在1000mL水中，混匀。 6.2.2将生理盐水分装在试管中，每管9mL，塞上棉塞，用牛皮纸把试管口包好，用蒸汽压力灭菌锅于（121±1）℃灭菌15min~30min。 6.3刻度吸管的灭菌 6.3.1将洗净并烘干后的吸管粗端塞上医用脱脂棉，棉花量要适宜，长度大约10mm～15mm，棉花不宜露在口外，多余的棉花可以用火焰烧掉。 6.3.2每支刻度吸管用一条约40mm～50mm宽的牛皮纸条，以45°左右螺旋形卷起来，吸管的尖部在头部，粗端将多余的纸条折叠打结，不使散开，标上量度，若干支扎成一束，置电热干燥箱中，于（160土 2）℃灭菌2h。 6.4培养皿的灭菌
将洗净并烘干后的培养皿10个左右叠在一起，用牛皮纸卷成一筒，置电热干燥箱中，于（160土 2）℃灭菌2h。 6.5采样瓶的灭菌
将洗净并烘干后的1000mL磨口试剂瓶瓶口和瓶颈用牛皮纸包好，扎紧，置电热干燥箱中，于（160±2）℃灭菌2h。 6.6硫代硫酸钠的灭菌
将硫代硫酸钠放人无菌箱（室）内，并均匀地摊在离紫外灯30cm处，灭菌30min。 7测定步骤 7.1将待测试样放人无菌箱（室）中，立即用75%（体积分数）的乙醇溶液浸泡的医用脱脂棉球擦手，点燃无菌箱（室）内的酒精灯。对试样的稀释和接种的操作均应在无菌箱（室）内的火焰区进行。 7.2用10倍稀释法稀释试样，即用1mL无菌刻度吸管吸取1mL待测试样注人9mL无菌生理盐水管中，充分摇匀，此时稀释度为10-1。 7.3另取一支1mL无菌刻度吸管吸取1mL稀释度为10-1的试样移到第二个生理盐水管中，充分摇匀，此时稀释度为10-2，依此类推，直至需要的稀释度为止。 7.4将不同稀释度的试样分别接种到无菌培养血中，每个稀释度重复接种3～5个血，每血接种1mL，接种时左手掌托住培养血，大拇指和食指轻轻将培养血盖提起，刻度吸管和培养血底成45°相接。移开吸管时吸管不宜再碰到培养血。接种时间不宜超过4S。每接种一个稀释度更换一支无菌吸管。 7.5将灭菌后的培养基冷却至（45士1）℃，按7.4的方法掀开培养血盖，将培养基灌人培养皿内，每血 2 HG/T 4207—2011
应灌10mL～15mL。灌皿时不要使培养基直接灌到水样上，灌皿后要将融化的培养基和皿中水样彻底混合，小心勿使混合液溅到培养皿的边缘。测定一个水样从接种到灌皿不得超过20min。 7.6培养
待培养皿中培养基固化后，倒置平皿，在生化培养箱中（29土1）℃培养72h。 8计数方法及报告方式 8.1选择平均菌数在30～300之间的稀释度，立即进行计数，求得平均菌落数，并修约成两位有效数字（见表1之例1）。 8.2若有两个稀释度，其生长菌落数均在30～300之间，则视二者之比值来决定，若其比值小于2，应报告其平均数；若大于2则报告其中较小的数字（见表1之例2和例3）。 8.3若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应选择稀释度最高的培养血计数，并修约成两位有效数字（见表1之例4）。 8.4若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应选择稀释度最低的培养血计数，并修约成两位有效数字（见表1之例5）。 8.5若所有稀释度均无菌落生长，则以“小于1乘以最低稀释倍数”报告之（见表1之例6）。 8.6若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一部分大于300而另一部分小于30时，则选择最接近30或300的培养皿计数（见表1之例7）。
表1
稀释度及菌落数
两稀释度菌落之比
菌落群总数 /(个/mL) 16 400 37 750 27100 313 000
报告方式 /(个/mL) 1.6×104 3.8×104 2.7×104 3.1×105 2.7×102
例次 1 2 3 4 5 6 7
×10-1
×10-2 164 295 271 3 475 11 0 306
×10-3 20 46 60 313 5 0 12
/
1. 6 2. 2
>6 500 27 0 0
270 <10 30 600
-
<10 3.1X104
9精密度 9.1由于微生物能以单独个体、双双成对、链状、成簇或一团团等形式存在，而且没有单独一种培养基能满足一个水样中所有细菌的生理要求。所以，由此法所得的菌落数可能要低于其正常存活的活细胞的数目。 9.2标准平皿计数的正确度随着平行样皿的增加而增加，当使用五个平行皿、每皿加1mL样品时测定结果的置信度为95%。 中华人民共和国化工行业标准
工业循环冷却水异养菌菌数测定 平血计数法
HG/T4207—2011 出版发行：化学工业出版社
（北京市东城区青年湖南街13号邮政编码100011)
化学工业出版社印刷厂
880mmX1230mm1/16 印张字数7千字
2012年3月北京第1版第1次印刷
书号：155025·1215
购书咨询：010-64518888 售后服务：010-64518899 网址：http：//www.cip.com.cn
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本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中国石油和化学工业联合会提出。 本标准由全国化学标准化技术委员会水处理剂分技术委员会（SAC/TC63/SC5)归口。 本标准由中海油天津化工研究设计院、深圳市华测检测技术股份有限公司、上海未来企业有限公
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1范围
本标准规定了工业循环冷却水异养菌菌数的测定方法。 本标准适用于工业循环冷却水中异养菌菌数的测定，也适用于原水、生活用水及其他水中异养菌菌
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（modGB/T6682—2008，ISO3696：1987)） 3方法提要
本方法采用平血计数法，将待测水样用10倍稀释法稀释至需要的稀释度，用移液管将不同稀释度试样1mL分别接种到无菌培养皿中，将冷却至（45±1）℃灭菌后的培养基10mL～15mL灌人培养皿内，混合均匀。待固化后置于（29士1）℃生化培养箱中培养72h，培养期满后按照计数方法进行计数。 4试剂和材料 4.1 牛肉膏(生物试剂）。 4. 2 蛋白陈（生物试剂）。 4.3 琼脂(生物试剂)。 4.4 氢氧化钠溶液（40g/L）。 4.5 乙醇溶液[75%（体积分数)]。 4. 6 氯化钠。 4.7 牛皮纸。 4.8 医用脱脂棉。 4.9 医用脱脂纱布。 4. 10 硫代硫酸钠。 5 ：仪器、设备 5. 1 常规微生物实验设备。 5.2无菌箱（室）或超净工作台。 5.3 蒸汽压力灭菌锅。 5.4 生化培养箱：（0～50）℃士1℃。 5.5电热干燥箱：温度可控制在（60～280）℃士2℃。 5.6玻璃培养皿或一次性灭菌塑料培养皿：d90mm。 5.7刻度吸管：1mL。 5.8 刻度吸管：10mL。
1 HG/T4207—2011 5.9试管（做盐水管用）d20mm×200mm。 5.10磨口试剂瓶：1000mL。 5.11糖瓷量杯：1000mL。 5.12锥形瓶：500mL。 6实验前的准备 6.1培养基的制备 6.1.1称取下列试剂：牛肉膏3.0g，蛋白陈10.0g，氯化钠5.0g，琼脂15g～20g。 6.1.2将上述试剂加水约950mL，在电炉上加热溶解后，趁热用四层医用脱脂纱布过滤于塘瓷量杯中，用热水补充至1000mL，用氢氧化钠溶液调节pH值至7.2～7.4，并分装在500mL锥形瓶中，每瓶分装量不超过其容积的三分之二。塞上棉塞，用牛皮纸把瓶口包好，用蒸汽压力灭菌锅于（121土1）℃ 灭菌15min~30min。
注：亦可直接购买市售的营养琼脂作为培养基。 6.2无菌稀释水的制备 6.2.1生理盐水的配制：称取8.5g氯化钠，溶解在1000mL水中，混匀。 6.2.2将生理盐水分装在试管中，每管9mL，塞上棉塞，用牛皮纸把试管口包好，用蒸汽压力灭菌锅于（121±1）℃灭菌15min~30min。 6.3刻度吸管的灭菌 6.3.1将洗净并烘干后的吸管粗端塞上医用脱脂棉，棉花量要适宜，长度大约10mm～15mm，棉花不宜露在口外，多余的棉花可以用火焰烧掉。 6.3.2每支刻度吸管用一条约40mm～50mm宽的牛皮纸条，以45°左右螺旋形卷起来，吸管的尖部在头部，粗端将多余的纸条折叠打结，不使散开，标上量度，若干支扎成一束，置电热干燥箱中，于（160土 2）℃灭菌2h。 6.4培养皿的灭菌
将洗净并烘干后的培养皿10个左右叠在一起，用牛皮纸卷成一筒，置电热干燥箱中，于（160土 2）℃灭菌2h。 6.5采样瓶的灭菌
将洗净并烘干后的1000mL磨口试剂瓶瓶口和瓶颈用牛皮纸包好，扎紧，置电热干燥箱中，于（160±2）℃灭菌2h。 6.6硫代硫酸钠的灭菌
将硫代硫酸钠放人无菌箱（室）内，并均匀地摊在离紫外灯30cm处，灭菌30min。 7测定步骤 7.1将待测试样放人无菌箱（室）中，立即用75%（体积分数）的乙醇溶液浸泡的医用脱脂棉球擦手，点燃无菌箱（室）内的酒精灯。对试样的稀释和接种的操作均应在无菌箱（室）内的火焰区进行。 7.2用10倍稀释法稀释试样，即用1mL无菌刻度吸管吸取1mL待测试样注人9mL无菌生理盐水管中，充分摇匀，此时稀释度为10-1。 7.3另取一支1mL无菌刻度吸管吸取1mL稀释度为10-1的试样移到第二个生理盐水管中，充分摇匀，此时稀释度为10-2，依此类推，直至需要的稀释度为止。 7.4将不同稀释度的试样分别接种到无菌培养血中，每个稀释度重复接种3～5个血，每血接种1mL，接种时左手掌托住培养血，大拇指和食指轻轻将培养血盖提起，刻度吸管和培养血底成45°相接。移开吸管时吸管不宜再碰到培养血。接种时间不宜超过4S。每接种一个稀释度更换一支无菌吸管。 7.5将灭菌后的培养基冷却至（45士1）℃，按7.4的方法掀开培养血盖，将培养基灌人培养皿内，每血 2 HG/T 4207—2011
应灌10mL～15mL。灌皿时不要使培养基直接灌到水样上，灌皿后要将融化的培养基和皿中水样彻底混合，小心勿使混合液溅到培养皿的边缘。测定一个水样从接种到灌皿不得超过20min。 7.6培养
待培养皿中培养基固化后，倒置平皿，在生化培养箱中（29土1）℃培养72h。 8计数方法及报告方式 8.1选择平均菌数在30～300之间的稀释度，立即进行计数，求得平均菌落数，并修约成两位有效数字（见表1之例1）。 8.2若有两个稀释度，其生长菌落数均在30～300之间，则视二者之比值来决定，若其比值小于2，应报告其平均数；若大于2则报告其中较小的数字（见表1之例2和例3）。 8.3若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应选择稀释度最高的培养血计数，并修约成两位有效数字（见表1之例4）。 8.4若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应选择稀释度最低的培养血计数，并修约成两位有效数字（见表1之例5）。 8.5若所有稀释度均无菌落生长，则以“小于1乘以最低稀释倍数”报告之（见表1之例6）。 8.6若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一部分大于300而另一部分小于30时，则选择最接近30或300的培养皿计数（见表1之例7）。
表1
稀释度及菌落数
两稀释度菌落之比
菌落群总数 /(个/mL) 16 400 37 750 27100 313 000
报告方式 /(个/mL) 1.6×104 3.8×104 2.7×104 3.1×105 2.7×102
例次 1 2 3 4 5 6 7
×10-1
×10-2 164 295 271 3 475 11 0 306
×10-3 20 46 60 313 5 0 12
/
1. 6 2. 2
>6 500 27 0 0
270 <10 30 600
-
<10 3.1X104
9精密度 9.1由于微生物能以单独个体、双双成对、链状、成簇或一团团等形式存在，而且没有单独一种培养基能满足一个水样中所有细菌的生理要求。所以，由此法所得的菌落数可能要低于其正常存活的活细胞的数目。 9.2标准平皿计数的正确度随着平行样皿的增加而增加，当使用五个平行皿、每皿加1mL样品时测定结果的置信度为95%。 中华人民共和国化工行业标准
工业循环冷却水异养菌菌数测定 平血计数法
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