ICS 13.300;13.020 A 80
A
中华人民共和国国家标准
GB/T30664-2014
化学品 两栖动物变态试验
Chemicals-Amphibian metamorphosis assay
2015-04-30实施
2014-12-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
发布 GB/T30664—2014
目 次
前言 1 范围 2 规范性引用文件 3 缩略语 4 方法原理 5
V
方法说明 5.1 试验物种 5.2 设备和用品 5.3 化学品可检测性 5.4 暴露系统 5.5 水质 5.6 试验用水中的碘化物浓度 5.7 动物饲养 5.7.1 成体饲育 5.7.2 蝌蚪饲养和选择 5.7.3 蝌蚪的培养和喂食 5.8 分析化学 5.9 化学品输送 5.10 试验浓度选择 6试验步骤 6.1 试验开始和进行 6.2观察
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6.2.1 一般说明 6.2.2 第7天测量 6.2.3 第21天测量（试验终止） 6.3生物学终点的测定 6.4 终点指标 6.4.1 般说明 6.4.2 发育阶段 6.4.3 HLL 6.4.4 体长和湿体重 6.4.5 甲状腺组织学 6.4.6 死亡 6.4.7 更多观察 7 数据和报告 7.1 数据采集
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7.1.1 试验物质 GB/T30664—2014
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7.1.2试验条件 7.1.3 结果 7.1.4数据报告 7.2性能标准和试验可接受性/有效性 7.3试验有效性· 7.4进行AMA的判定逻辑 7.4.1AMA的判定逻辑流程 7.4.2 提前发育（通过发育阶段、SVL和HLL判定） 7.4.3不同步发育（用发育阶段标准判定) 7.4.4 组织病理学 7.4.5发育延迟（用发育阶段、HLL、身体湿重、SVL判定） 7.5统计分析· 7.6特殊数据分析考虑 7.6.1有不良影响试验浓度的使用
....
...
7.6.2溶剂对照 7.6.3达到60及更高发育阶段的处理组
附录A（资料性附录） 21天两栖类变态试验的试验条件附录B（资料性附录）原始数据和总结数据报告表附录C（资料性附录） 有一个或更多浓度的后期发育蝌蚪数超过20%时的体重和体长
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分析备选方法
参考文献
图151阶段非洲爪蟾蝌蚪的后肢形态图2非洲爪蟾蝌蚪的体长测量和HLL测量图3进行AMA的判定逻辑图4连续效应数据的统计检验方法流程图
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表1流水条件下AMA非洲爪蟾蚪生存期间喂食方案表2根据Neuwkoop和Faber指导的突出形态学阶段标志表3AMA主要终点的观察时间点表4AMA的性能标准表A.1 21天两栖类变态试验的试验条件表 B.1 受试化学品的一般信息表 B.2 第7天和第21天原始数据采集表表 B.3 第7天和第21天终点数据的计算总结表 B.4 每日死亡率数据表 B.5 水质标准表 B.6 化学数据总结表 B.7 核心标准的组织病理学报告表 II
17 18 18 21 22 23 23 24 GB/T30664—2014
表B.8 其他组织病理学标准表B.9 组织病理学结果的叙述性说明表B.10 AMA第7天或第21天的总结报告表模板· 表 B.11 AMA第7天或第21天发育阶段数据的总结报告表模板
25 26 ..27 ......28
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Ⅱ GB/T30664—2014
前 言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准与经济合作与发展组织（OECD)化学品测试导则No.231（2009年）《两栖动物变态测试评
价》(英文版)技术内容一致。
本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国科学研究院生态环境研究中心。 本标准主要起草人：程艳、秦占芬、崔媛、陈会明、李晞、张银凤、谢文平。
V GB/T30664—2014
化学品 两栖动物变态试验
1范围
本标准规定了化学品两栖动物变态试验的方法原理、方法说明、试验步骤、数据和报告。 本标准适用于化学品两栖动物变态测试。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
ASTME729用鱼类、大型无脊椎动物和两栖类动物进行受试材料急性毒性试验的标准指南 (Standard guide for conducting acute toxicity tests on test materials with fishes, macroinvertebrates and amphibians)
ASTME1439非洲爪蟾胚胎致畸试验的标准指南（FETAX)[Standardguideforconductingthe frog embryoteratogenesisassay—Xenopus(FETAX))
NieuwkoopPD，FaberJ非洲爪蟾生长发育表（NormaltableofXenopuslaevis）
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。 AMA：两栖类变态试验（amphibianmetamorphosisassay）。 HPT：下丘脑-垂体-甲状腺（hypothalamic-pituitary-thyroid）。 SVL：口至泄殖孔的长度（snouttoventlength）。 hCG：人绒毛膜促性腺激素（humanchorionicgonadotropin）。 DO：溶解氧(dissolvedoxygen)。 MTC：最大耐受浓度（maximumtoleratedconcentration）。 LCso：半数致死浓度（lethalconcentration50）。 TSH：促甲状腺激素（thyroidstimulatinghormone）。 HLL：后肢长度（hindlimblength）。 OECD：经济合作与发展组织（organisationforeconomicco-operationanddevelopment）。 NF：NieuwkoopPD，FaberJ（1994)中对非洲爪蟾正常发育的形态学标准发育阶段分级（Nieuwk
oop and Faber)。
4方法原理
4.1AMA是一项筛选试验，其用途是凭经验鉴别可能会干扰HPT轴正常功能的物质。在HPT轴保守的结构和机能的范围内，AMA代表了一种广义的脊椎动物模型方法。这是一项重要的试验，因为两栖类变态是一个研究较为成熟的、甲状腺依赖性的过程，该过程对HPT轴内的活性物质有应答，并且这是目前唯一的检测形态学发育中动物甲状腺活性的试验。
1 GB/T 30664—2014 4.2 2试验设计一般是将51阶段的非洲爪蟾蝌蚪暴露于至少3种不同浓度的受试化学品和稀释用水（对照)中21天。每种试验处理设4个平行。试验开始时所有处理组的蝌蚪密度都是每个试验缸20只蝌。观察终点是HLL、SVL、发育阶段、湿体重、甲状腺组织学和每日死亡率。
5方法说明
5.1试验物种
非洲爪蟾在全世界的实验室里都可以常规培养，也可以通过商业渠道获得。全年均可通过注射 hCG诱导使该物种繁殖，并且获得的蝌蚪一般可大量饲养到所选择的发育阶段，用于阶段特异性试验。 该试验使用的蝌蚪最好是来源于内部成体。虽然不是首选方法，但也可以将卵或胚胎运到进行试验的实验室使其适应新的环境；但不能运送蝌蚪用于试验。 5.2设备和用品
进行本试验需要以下设备和用品： a) 暴露系统（见5.4)； b) 玻璃或不锈钢材质的鱼缸（见5.4）； c) 饲育缸； d) 温度控制装置[如：加热器或制冷器（可以调节到22℃士1℃）； e) 温度计； f) 双目解剖显微镜； g) 分辨率至少为4百万像素并有微距功能的数码照相机； h) 图像数字化软件； i) Petri培养皿（如100mm×15mm)或大小相近的透明塑料盒； j) 分析天平，精确到3位小数（mg）； k）溶氧计； 1 pH计; m) 光强计，能以1x为单位； n) 其他实验室用玻璃器具和工具； o) 可调式移液器（10μL5000μL)或各种大小相当的吸量管； p) 足量的受试化学品，最好为同一个批号； q 适用于受试化学品的分析仪器，或将分析服务外包。
5.3化学品可检测性
AMA的试验基础是采用流水试验方案，即通过流水系统将受试化学品引入试验容器。但是，流水法则导致受试化学品的类型受到化学品理化特性的限制。因此在使用该方案前，需了解受试化学品是否可以进行相关测试的基础信息，并参见OECD难于进行测试的物质和混合物水生毒性检测的指导文件1)。表明化学品可能难以在水生系统中测试的特性包括：辛醇水分配系数（1gK。）高、挥发性强、容易水解以及在实验室环境光照条件下容易光解。根据具体情况可能还需要考虑其他因素。如果该化学品不能使用流水系统进行试验，可以采用半静态式系统。如果这两种系统都无法测试该化学品，则不采用该试验方案。
1】参见参考文献[1]。 2 GB/T30664—2014
5.4暴露系统
在可能的情况下，流水式系统与半静态系统相比，首选前者。如果受试化学品的物理和/或化学性质不适用流水式系统，可以选用其他暴露系统（如半静态系统）。该暴露系统包括玻璃、不锈钢和/或聚四氟乙烯等接触水的组成部分。但在不影响研究效果的情况下也可以采用合适的塑料。暴露缸是玻璃或者不锈钢材质的鱼缸，带有储水塔，容积约为4.0L～10.0L，水深最少为10cm～15cm。该系统需能支持所有的暴露浓度和一个对照，每种处理设4个平行。考虑到试验动物条件的维持和化学品暴露，塔向每个缸的流速恒定（如25mL/min）。为了减少潜在的位置效应，包括温度、光强度等轻微差异，处理缸随机分配至暴露系统中的一个位置。使用荧光灯，光周期为12h光照：12h黑暗，水表面处的光强度范围为6001x～20001x(1m/m"）。每个试验缸的水温维持在22℃士1℃，pH保持在6.5～ 8.5，DO浓度大于3.5mg/L（大于空气饱和的40%）。至少每周测一次水温、pH和DO；至少连续测量一个试验容器的温度。附录A中列出了执行该方案的试验条件。更多关于建立流水式暴露系统和/或半静态系统的信息，见ASTME729以及常见的水生毒性试验测试。 5.5水质
只要是当地可用的（如泉水或经活性炭过滤的自来水)并能使非洲爪蟾蝌蚪正常生长发育的水都可以使用。不同地区的水质可能存在较大差异，尤其是当没有使用这种水来饲养爪蟾的历史数据时，需进行水质分析。特别注意水中不得含铜、氯和氯胺，这些物质对非洲爪蟾和蝌蚪有毒。进一步建议分析水中氟化物、高氯酸盐和氯酸盐（饮用水消毒的副产物)的背景水平，因为这些阴离子都是甲状腺碘运载蛋白的底物，任何一种阴离子水平升高都可能混淆研究结果。在试验前进行分析，正常情况下试验用水不得含这些阴离子。 5.6试验用水中的碘化物浓度
为了让甲状腺合成甲状腺激素，蝌需能从水和食物中获得足够的碘化物。目前尚没有关于最低
碘化物浓度的经验指南。但碘化物的摄人可能会影响甲状腺系统对甲状腺活性物质的反应性，并且已知摄人碘化物可调节甲状腺的基础活性，这是解释甲状腺组织病理学结果时值得注意的一点。因此需报告试验用水中测得的碘化物浓度。根据验证研究的可用数据，已证明当试验用水的碘化物（I-）浓度在0.5ug/L～10ug/L时该试验方案效果良好。理想情况下，试验用水的最低碘化物浓度为 0.5μg/L。如果试验用水是由去离子水配制的，需添加碘，使最低浓度达到0.5μg/L。报告中应注明试验用水的碘或其他盐类添加情况。
5.7动物饲养
5.7.1成体饲育
成体饲育按照标准指南ASTME1439进行，更多信息可参见FETAX标准指南。这类标准指南提供了一个适当的饲育方法范例，但不要求严格遵守。为了诱导育种，给成对（3对～5对）的成年雌性和雄性蛙注射hCG。雌性和雄性样本分别约注射溶解于0.6%～0.9%盐水的800IU～1000IU、 600IU～800IU的hCG。为了促进抱对，将育种的成对样本置于大缸中，在静态条件下，不受打扰。 每个育种缸底部有一个不锈钢或塑料做的网格，可以让卵团落到缸底。傍晚时注射的蛙通常在第二天上午时产卵最多。当足够数量的卵产出并受精后，将成体蛙从育种缸中取走。
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