ICS 13.300; 11. 100 A 80
GB
中华人民共和国国家标准
GB/T 28646—2012
化学品
体外哺乳动物细胞微核试验方法
Chemicals-Test method of mammalian cell micronucleus in vitro
2012-07-31发布
2012-12-01实施
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
发布 GB/T28646—2012
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准同经济合作与发展组织（OECD)化学品测试导则No.487(2010)《体外哺乳动物细胞微核试
验》（英文版)技术性内容一致。
本标准做了下列结构和编辑性修改：
将OECD487原文中的“简介”和“初步考虑”部分内容作为本标准的“引言”； ——将OECD487原文中“附录：定义”中的部分内容作为本标准中的"2术语和定义” 增加了范围一章。 本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。 本标准起草单位：中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所、辽宁省职业病防治院、中国化工
经济技术发展中心、中国检验检疫科学研究院。
本标准主要起草人：孙金秀、曲波、林、李雪飞、白羽、王晓兵、李晞。
I GB/T28646—2012
引言
本试验的目的是通过检测处于间期细胞的胞质中微核（micronuclei，MN)形成的频率，评价受试物的遗传毒性。微核可来源于无着丝粒的染色体断片或在细胞有丝分裂后期不能迁往细胞两极的整条染色体。该试验用于检测在细胞暴露受试物期间或暴露后受试物对经历过分裂的细胞诱发断裂和非整倍体作用的活性(1-2]。本标准规定在制定的操作规范中允许使用和不使用细胞胞浆移动阻断剂一松胞素B(cytochalasinB，cytoB)两种方式进行试验。在细胞有丝分裂期前加入cytoB，可阻断细胞质分裂，使细胞为双核细胞[3-4]，从而可在完成了一次细胞分裂的细胞中进行微核的识别以及微核发生率的选择性分析。如能提供所分析的细胞群发生了有丝分裂的证据时，可按不使用cytoB进行试验操作。
另外，使用本方法除了可以鉴定化学物诱发微核外，还可应用胞浆移动阻断剂、着丝点免疫标记、和
着丝粒/末端着丝粒探针杂交技术（原位免疫荧光杂交技术，fluorescenceinsituhybridisation，FISH），提供染色体损伤和微核形成机制的信息[5-16]。在观察到微核形成增加，并希望确定这种增加是断裂作用还是诱发非整倍体作用，可应用标记和杂交的技术进行操作。
微核损伤是可以传递到子细胞的，而分裂中期细胞出现的染色体畸变是不能传递到下一代细胞；由于所检测到的间期细胞微核是比较客观的，因此试验人员只需要测定细胞是否经过了分裂，以及含微核的细胞有多少。所以，标本的制备、分析记录相对比较迅速，而且也能实现自动化分析；这使原来只能对每个处理组计数分析数百个细胞增加到数千个细胞，从而增加了试验方法的检测效力。最后，如果微核来源于滞后的整条染色体，本方法可对使用传统的染色体畸变分析（OECD473)存在困难的诱发非整倍体作用的化学物进行检测分析17。但是，如果不使用FISH等特异性技术，体外微核试验是不能鉴别化学物是诱发多倍体剂还是断裂剂。
体外微核试验是在试管内体外条件下使用培养的人体或啮齿类细胞进行的试验。由于本试验同时能检测到非整倍体剂作用和断裂剂作用，因此可为探讨体外条件下染色体的潜在损伤作用提供综合基础。
体外试验通常需要使用外源性代谢活化系统。外源性代谢活化系统不能完全模拟体内代谢条件。 应注意避免存在影响化学物固有的致突变活性的因素，如pH值、或渗透压的明显改变、或者是在高浓度下引起严重细胞毒性的条件进行试验，以免发生假阳性结果。
为了分析诱发微核作用，最关键的是处理组和对照组培养物的细胞核必需已经经历过或完成了核分裂。计数微核最有利的时期是受试物处理期间或处理后细胞已经完成一个有丝分裂的阶段。
体外微核试验应用多种细胞类型进行试验都是非常有效的，无论是在用或不用cytoB处理的情况下；如已经有大量的研究资料表明体外微核试验应用各种啮齿类细胞株（CHO、V79、CHL/IU和 L5178Y)和人体淋巴细胞都被确认是非常有效的[8.19-31]。其中包括，特别是由遗传毒性技术科学委员会 (SociétéFrancaisedeToxicologieGenétique，SFTG)主持的国际有效性合作研究[8.19-22]和国际遗传毒性试验工作组的报告。
已有欧盟替代方法有效性[4.16)的欧洲中心（EuropeanCentrefortheValidationofAlternative Methods，ECVAM）-项权重证据回顾性的有效性研究所作的再评价的资料[2,33-34]，并且该组织的专家顾问委员会（ECVAMScientificAdvisoryCommittee，ESAC)认为体外微核试验是科学有效的。已经有使用TK6类成淋巴细胞系C5]、HepG2细胞株C36-37]和叙利亚地鼠胚胎细胞的报告[38]，尽管这些细胞尚未进行有效性研究。
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化学品
体外哺乳动物细胞微核试验方法
1范围
本标准规定了化学品体外哺乳动物细胞微核试验方法的术语和定义、试验原理、试验方法、试验数据和报告。
本标准适用于化学品体外哺乳动物细胞微核试验。
2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
2. 1
非整倍体诱导（剂） aneugen 通过与细胞有丝分裂和减数分裂周期相关的成分相互作用，引起细胞或生物体非整倍染色体形成
的任何物质（非整倍体诱导剂)或过程。 2. 2
非整倍体 aneuploidy 染色体数与正常二倍体（或单倍体)染色体数不同，其数目或是单条或多条的染色体的增多或减少，而不是整套染色体的偏移，整套染色体的改变为多倍体。
2.3
细胞凋亡apoptosis 是细胞的程序化死亡，其特点是细胞经一系列连续的崩解步骤变成被膜包围的微粒，然后被吞噬细胞吞噬或蜕落排除。
2. 4
细胞增殖cellproliferation 作为细胞有丝分裂的结果，细胞的数量增加。
2.5
着丝粒 centromere 一条染色单体内的两条染色单体连接在一起的脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid，DNA)区域。
2.6
断裂（剂）clastogen 能够引起细胞群或生物体的染色体结构畸变的任何物质或过程。
2.7
细胞浆分裂 cytokinesis 细胞核在有丝分裂或减数分裂后形成两个子细胞的胞浆分离过程。
2.8
胞浆移动阻断增殖指数 cytokinesis-blockproliferation index,CBPI 胞浆移动阻断剂处理组的细胞群的激发分婴细跑数与未处理的细胞群对照的比率。
1 GB/T28646—2012
2. 9
细胞分裂停滞cytostasis 细胞生长增殖抑制。
2. 10
细胞毒性cytotoxicity 对细胞结构或功能的有害作用，最终可致细胞死亡。
2. 11
遗传毒性genotoxicity 涵盖DNA和染色体所有损伤的一般性术语，包括断裂、加合物、再排列、突变、染色体畸变和非整
倍体。不是所有的遗传毒性作用都会导致突变或稳定的染色体损伤。 2. 12
着丝点kinetochore 在细胞分裂期间纺锤丝与染色体的着丝粒相聚合，使子细胞的染色体有规则地向两个子细胞极端
移动的含蛋白的结构物。 2. 13
微核micronuclei 从细胞主核分离并独立于细胞主核的小核，由在细胞有丝分裂或减数分裂末期遗留在胞质内的染
色体片段或整条染色体形成。 2. 14
有丝分裂指数mitoticindex 中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值，是一项反映细胞增殖程度的指标。
2.15
致突变mutagenic 基因上的DNA碱基对序列或染色体的结构（染色体畸变)产生了可遗传的改变。
2. 16
不分离non-disjunction 配对的染色单体不能拆开和不能分开到子细胞中，结果子细胞中的染色体数目异常。
2. 17
多倍体polyploidy 细胞或生物体中整套的染色体数目畸变，与单条染色体或多条染色体(非整倍体)不相同的。
2. 18
增殖指数proliferationindex，PI 不使用cytoB时测定细胞毒性的方法。（见附录A的公式）
2. 19
细胞计数增加比率relativeincreaseincellcount，RICC 不使用cytoB时测定细胞毒性的方法。（见附录A的公式）
2. 20
细胞群倍增比率relativepopulationdoubling，RPD 不使用cytoB时测定细胞毒性的方法。（见附录A的公式）
2.21
复制指数replicationindex，RI 在暴露期和恢复时处理组完成的细胞分裂与未处理的对照相比所占的比率。（见附录A的公式）
2 GB/T286462012
3试验原理
人体和哺乳动物来源的细胞体外培养，在加和不加（所使用的细胞对所研究的受试物具有足够的代谢能力外来的代谢活化系统情况下暴露于受试物。试验时均设平行的溶剂/载体对照和阳性对照。在暴露受试物期间、暴露后细胞经足够的时间生长，能让在细胞间期由受试物造成的染色体或纺锤体的损伤形成微核。测定诱导非整倍体作用应在有丝分裂期间接触受试物。只对在暴露期间或在暴露后完成有丝分裂细胞微核进行分析。在培养物进行胞浆移动阻滞处理时只计数双核细胞的微核，未进行胞浆移动阻滞处理的应证实所分析的细胞在暴露期间和暴露受试物后已经进行了细胞分裂。所有的操作，都要证明处理组和对照组的培养物的细胞发生了细胞增殖，并对分析微核培养物（或平行培养物)由受试物引起的细胞毒性或细胞停滞程度进行评价。
进行体外试验一般需要使用外源性代谢活化系统，除非试验所用的细胞对受试物具有代谢活化能力。外源性代谢活化系统是不能完全模拟体内的条件；应当注意避免出现如pH值和渗透压的明显改变；或者严重的细胞毒性[39-41]。如果受试物加人培养介质后引起了的pH值的变化，应当首选缓冲液的储备液调整pH值，使所有的试验浓度组与对照组的试验液体的体积相同。
为了对微核诱导作用进行分析，需要处理组和非处理组的细胞核发生分裂；计数微核最为适当的阶段是在受试物处理期间或处理后细胞已经完成了一次有丝分裂之后。
4试验方法
4.1准备 4.1.1细胞
原代培养人体外周血淋巴细胞[5.19.42,43)和啮齿类细胞株（如CHO、V79、CHL/IU和L5178Y)都可以使用的[18-2,25-28,30]。使用其他细胞株和细胞类型应根据本标准规定可接受的条件说明其合理性。由于微核发生的背景频率可影响到试验方法的敏感性，建议试验中使用微核背景频率较低、稳定的细胞类型。
使用人体外周淋巴细胞，应当从年轻的（年龄18岁～35岁）、健康的、不吸烟的、近期未暴露已知的遗传毒性化学物和放射性的个体获得；如果从一个以上的供血者得到的细胞混合使用，应当说明供血者的数量；女性的微核频率随着年龄增加而增加的现象要比男性更为明显[44]，因此在选择混合使用的供血者时应予以注意。 4.1.2培养基和培养条件
细胞培养时应使用合适的培养基和培养条件（如培养皿、CO浓度、温度和湿度）。使用已建系的细胞株应当常规地对其染色体数目的稳定性和是否有支原体污染状况进行检查验证。不应使用含有支原体污染或染色体数目改变了的细胞株。掌握本试验室培养条件下所使用的细胞的正常细胞周期时间；如用胞浆移动阻断剂处理细胞，其使用浓度应根据所特定使用的细胞类型进行优化，并能产生良好的便于分析的双核细胞。 4.1.3培养细胞和cytoB的制备 4.1.3.1已建系的细胞株：从干培养物中取出进行细胞增殖；使收获前不影响单层细胞的覆盖度或者在悬浮培养时不产生过量细胞密度来进行接种，并在37℃培养。 4.1.3.2淋巴细胞：用抗凝剂（如肝素）处理的全盘，或是分需得到的淋巴细胞，在暴露受试物和加人
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cytoB之前在含有促细胞分裂剂如植物血球凝集素（phytohaemagglutinin，PHA）的培养基中进行培养。 4.1.4代谢活化
当选用的细胞缺乏内源性代谢能力时需使用外源性代谢活化系统。最常用的活化系统是从经酶诱导物如Aroclor1254[45-46]、或是苯巴比妥与β萘黄酮混合物处理的啮齿类动物肝脏后线粒体（post-mi- tochondrial)组分(S9)再加其他辅助因子组成[46-49]。诱导时，后者更符合关于持久性有机污染物斯德哥尔摩公约的规定[50]，并被证明在诱导混合功能氧化酶上与Aroclor1254同样有效[46-49]。
S9组分在培养基中的终浓度一般为体积分数1%～10%。代谢活化系统的使用可能取决于受试物的种类，在某些情况下可能需要使用一种以上的S9的浓度。
经遗传工程构建的可以表达人类或啮齿类动物特异性活化酶的某些细胞株可能不需要外源物活化系统，可以作为试验细胞；但应当取得这些特异性活化酶与受试物代谢的混合功能氧化酶之间存在
关联性，以及他们在对已知的断裂剂和诱发非整倍体剂的所起的作用等证明是有科学依据的[51]。研究者应当清楚受试物可能不会被表达的混合功能氧化酶所代谢，此时所得到的阴性结果并不表示受试物不具有诱发微核的作用。 4.1.5受试物的准备
固体的受试物应当溶解在适当的溶剂和载体中，然后在暴露处理细胞前再进行适当的稀释；液态的受试物可以直接/或在处理细胞前经稀释加人到试验体系中；气态或挥发性受试物的蒸气要对标准操作程序做适当修改，如在密闭容器中进行暴露处理等[52-53]。试验时应使用新鲜配制的受试物，如有制备物的稳定性数据证明储存物是可接受的，仍可使用储存的制备物。 4.2试验条件 4.2.1溶剂/载体
溶剂/载体不应当与受试物发生反应，或所使用的浓度不能影响细胞的存活或影响S9活性的维持；不使用已为大家接受的溶剂/载体（如水、培养基、二甲基亚砜）而使用其他溶剂/载体，要有资料支持这些溶剂与受试物相适合，并不具有遗传毒性。推荐尽可能地首选水作为溶剂/载体。 4.2.2使用cytoB作为胞浆移动阻断剂 4.2.2.1进行体外微核试验时要确保所分析计数微核的细胞是在暴露处理期间或在处理后的培养期间已经完成了有丝分裂的细胞。cytoB是一种广泛应用的胞浆移动阻断剂。推测其通过抑制肌动蛋白的集结组合作用，在有丝分裂后可阻止两个子细胞的分离，导致双核细胞的形成[5,54-5]；所以微核的计数分析只限定对在处理期间或处理后经过了有丝分裂的细胞。应同时测定受试物对细胞增殖动力学的影响。还有已经使用的其他方法用于确定所分析的细胞是否已经发生分裂。当使用人体淋巴细胞进行试验时，规定应使用cytoB进行处理，这是因为培养物内彼此之间和供血者之间细胞周期时间互不相同，也因为不是所有的淋巴细胞都对PHA发生反应。 4.2.2.2cytoB的合适浓度一般为3μg/mL～6μg/mL。试验室应测定每种细胞类型使用cytoB合适浓度，以保证在溶剂/载体对照组中获得理想的双核细胞频率。 4.2.3染毒浓度、细胞增殖和细胞毒性的测定 4.2.3.1当选择最高浓度时，应避免引起假阳性反应的浓度，如过度的细胞毒性、在培养基中出现沉淀、pH值和渗透压的明显改变等[39-41]。
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4.2.3.2测定细胞增殖，证实暴露处理的细胞在试验期间发生有丝分裂，并保证暴露处理是在引起适当的细胞毒性水平进行。在不使用cytoB时，对不需代谢活化的细胞进行试验，应测定外加和不加代谢活化系统条件下的细胞毒性，其指标是RICC、RPD(见附录A）。在使用cytoB情况下，可以通过测定复制指数来表示细胞毒性。 4.2.3.3用cytoB处理培养的细胞，测定培养物中单核、双核和多核细胞相对出现频率可提供暴露处理对细胞增殖作用、细胞毒性和细胞停滞作用的准确的定量5]，并能确保只对暴露处理期间和处理后发生分裂的细胞进行分析计数。
在使用cytoB的试验中，细胞停滞/细胞毒性可以由CBPI来进行定量[5.26.56]；或者通过每个培养物至少500个细胞推算出来的RI来定量（见附录A）。此时对细胞的增殖评价，也是通过对每个培养物至少500个细胞来测定推算CBPI或RI。还可以通过对处理和对照培养物的一些测定得到的量值大小进行比较来估算细胞毒性。评估细胞毒性的其他标志，如细胞覆盖程度（confluency）、细胞数量、细胞调亡、坏死变性、中期相数等都可以提供有价值的信息。
在不使用cytoB的试验中，应证明所计数的细胞在暴露处理期间或处理后已发生了有丝分裂，否则可能得到假阴性反应的结果。证实细胞发生了分裂的方法，可用5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)掺入细胞后并对其进行测定，鉴别出已发生了复制的细胞57；对来源于耐受细胞株形成的克隆进行处理，可在显微镜下进行原位观察分析得到PIC25-28]；或测定RPD，或RICC；也可使用文献[16.56.58,59]所提供的方法（见附录A）。评估细胞毒性和细胞停滞的其他标志，如细胞覆盖度、细胞数量、细胞调亡、坏死变性、中期相数量等都可以提供有价值的信息。 4.2.3.4至少要评价3个可供分析的试验浓度组。为此，应设多个组距较近的浓度组，根据各浓度组微核形成情况，得到引起细胞毒性适宜的浓度范围；也可进行细胞毒性预试验来缩窄最后进行试验的浓度范围。最高浓度组的细胞毒性发生率应控制在55%土5%；较高的浓度水平应达到能因细胞毒性而继发产生染色体损伤；要求所设试验浓度出现细胞毒性发生率应涵盖从引起55%士5%到引起轻微或没有细胞毒性的范围。 4.2.3.5最高试验浓度，如没有过高细胞毒性和受试物过浓而沉淀析出等，应当达到0.01M， 5mg/mL或5μL/mL。可以任何一个浓度作为最低的浓度组60]；一般情况下所选择的进行分析的浓度的组间距应不要超过√10；出现较陡峭的剂量-反应曲线的受试物，其浓度组距的设置应当比较密，这样对中、低浓度组也能进行计数分析。 4.2.3.6如受试物最高浓度的细胞毒性未超过规定的上限，而受溶解性所限，此时最高浓度应达到培养物中可见到极少沉淀的浓度作为最低浓度，当然这个浓度不应当干扰计数分析。可用光学显微镜来评价沉淀物的状态，说明沉淀是持续存在的还是培养期间（处理结束)产生的。 4.2.4对照 4.2.4.1每个试验都应同时设加和不加代谢活化系统的阳性对照组和阴性对照组（溶剂/载体对照组）。 4.2.4.2 阳性对照物：为了证实对所用细胞的作用能力、试验方案的正确性、是断裂剂还是诱发非整倍体剂、S9制备物的代谢活化能力等都需要设阳性对照。阳性对照物应当是已知的给予尽可能少的量就能诱发微核形成的物质，其诱发的超过微核形成背景频率范围的增加是可重复的，并要证实试验系统对阳性物的敏感性。阳性对照物的浓度应达到引起明确作用的浓度，但是不能让阅片人直接认出标本是哪一组的。 4.2.4.3应当使用需要代谢活化的断裂剂（如环磷酰胺，苯并）来证实试验系统的代谢活化能力和试验系统对断裂剂的检测能力。如果有根据也可使用其他阳性对照物。由于某些需要代谢活化的阳性对照物，在某些处理条件下或者在某些细胞株在没有外源性代谢活化系统下也可被活化，因此要求在所用细胞株和设定试验浓度下对代谢活化作用和S9制备物的活性进行试验。到目为止，还没有已知的非
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