ICS 13.300;11.100 A 80
GP
中华人民共和国国家标准
GB/T29764—2013
化学品 青鱼早期生命阶段毒性试验 Chemicals-Fish (Oryzias latipes,d-rR Medaka) early life stage toxicity test
2014-03-20实施
2013-09-18发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
中国国家标准化管理委员会 发布 GB/T 29764—2013
目 次
前言范围
1
1
2 规范性引用文件 3术语和定义受试物信息
4 5 方法概述 6 仪器设备
试验准备试验程序
2
8 9 质量保证与质量控制 10数据与报告·
t
附录A（资料性附录） 青鳞（Oryziaslatipes，d-rRMedaka)驯养繁殖和培育的环境参数附录B（资料性附录） 合格稀释水的化学特征附录C（资料性附录） 孵化液的配制成分参考文献
8
10 11 12 GB/T 29764—2013
前 言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准参照了经济合作与发展组织(OECD)化学品测试导则No.210(1992年)《鱼类早期生命阶段
毒性试验》（英文版），并主要增加了以下内容：
受试生物选用d-rR品系青，增加了d-rR品系青鳞新孵化幼鱼、幼鱼和亲本的投喂次数、投喂量等资料；一异常特征中增加了多种胚胎损伤和幼鱼畸形表述；在性别比率表述中增加了雌雄形态区别；统计参数增加了试验结束时雌雄鱼性别比率。
本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。 本标准起草单位：中国科学院生态环境研究中心、中国检验检疫科学研究院、环境保护部化学品登
记中心、上海市检测中心。
本标准主要起草人：查金苗、王子健、李伟、朱莉飞、李兆利、李晞、程艳、刘纯新。
m GB/T 29764—2013
化学品 品青鱼早期生命阶段毒性试验
1范围
本标准规定了青筛鱼（d-rR品系青鳍，以下简称“鱼”)早期生命阶段化学品毒性试验的方法概述、 仪器设备、试验准备、试验程序、质量保证与质量控制、数据与报告。
本标准适用于测试化学品对鱼类早期生命阶段（胚胎发育和幼鱼生长阶段）的毒性。
规范性引用文件
2
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T27861化学品鱼类急性毒性试验
：术语和定义
3
下列术语和定义适用于本文件。
3. 1
最低可观察效应浓度 lowestobservedeffectconcentration;LOEC 与对照组相比，对受试物产生显著效应（p<0.05)的最低受试物浓度。
3. 2
无观察效应浓度 no observed effect concentration;NOEC 试验中直接低于LOEC的受试物浓度。
3.3
半数致死浓度 median lethal concentration;LCso 引起50%的受试鱼死亡的受试物浓度，以LCso表示。
受试物信息
4
a) 结构式； b) 纯度； c) 水中溶解度； d) 蒸汽压； e) 水解离常数(pKa)； f) 正辛醇/水的分配系数（Pw）； g) 在水中和光中的稳定性； h) 在试验液中受试物的可靠定量分析方法及其精确度、检测限； i) 在试验条件下的稳定性； j) d-rR品系青绨的LCs。值； k) 快速生物降解性试验结果。 GB/T29764—2013
5方法概述
鱼类早期生命阶段毒性试验优先采用流水式试验系统，可选择半静态（静水更新）试验系统，将胚胎-幼鱼阶段的受试鱼（d-rR品系青）暴露于定浓度范围的受试物水溶液中。试验自受精卵放人试验容器时开始，至幼鱼达到21日龄时结束。通过测定受试鱼的致死和亚致死效应，并与对照组值相比较来测定受试物的LOEC和NOEC。
6仪器设备
仪器设备如下： a）实验室常规仪器设备； b）测定水温、pH值、溶解氧和硬度的仪器； c) 温度控制仪； d) 试验容器或装置：全玻璃、不锈钢或其他化学惰性材质制成，容器的尺寸符合负荷率标准。流
水式试验方法采用流水式试验装置，具备受试物贮备液连续分配和稀释系统，并具控温、充气、 流量等装置。
7试验准备
7.1系统选择
试验期间应尽可能维持条件的恒定，推荐流水式试验系统或半静态试验系统。 7.2受试生物 7.2.1受试生物的选择
本试验推荐受试生物为d-rR品系青鳞。 7.2.2受试生物的驯养
亲鱼剔化所需适宜条件的详细资料可参见附录A。 7.3试验水质
试验用水符合附录B要求，或参照附录C配制孵化液作为试验用水。实验用水应满足以下要求：对照组中受试鱼的孵化率应大于或等于80%，孵化后幼鱼的存活率应大于或等于80%。试验期间应保持水质恒定，并对水样进行定期分析，以保证稀释不会对试验结果和亲鱼繁殖产生不良影响（例如对受试物的络合作用）。稀释水样的水质分析指标包括：重金属（如Cu2+、Pb2+、Zn2+、Hg2+、Cd2+、 Ni2+），主要阴、阳离子（如Ca2+、Mg2+、Na+、K+、CI-、SO,2-），常见农药，总有机碳和悬浮物等。 7.4试验溶液 7.4.1通过稀释受试物的浓缩贮备液（母液)来配制所选择浓度的试验溶液。 7.4.2备液配制：最好选择机械方法（如搅拌或超声），使受试物在稀释水中简单地混合或搅动。根据受试物溶解度值来确定浓缩贮备液的适宜浓度。某些情况下，配制高浓度贮备液需要添加助溶剂或分散剂，但应尽可能避免使用。适合本试验的助溶剂有：丙酮、乙醇、甲醇、二甲基亚砜、二甲基替甲酰
2 GB/T29764—2013
胺、三甘醇。适合本试验的分散剂有：聚氧乙烯化脂肪酸甘油酯、吐温-80、0.01%的纤维素甲醚、聚氧乙烯化葩麻油。在流水试验中，如果使用容易生物降解的试剂（如丙酮）和（或）高挥发性化合物时，应注意这些物质可能会随着细菌的聚集而产生一些问题，影响试验结果。当使用某种助溶剂或分散剂时，助溶剂或分散剂浓度不能超过0.1mL/L，且在所有容器中浓度一致。 7.4.3对于流水式试验，应有连续分配和稀释受试物贮备液的系统（如计量泵、比例稀释器和饱和系统），将贮备液和稀释水按照一定比例和一定流速输送至试验容器，从而得到一系列浓度的试验溶液。 在试验期间，应定期检查贮备液和稀释水的流速，最好为每天检查，且试验期间的流速变化应不超过 10%。流速大小的选择，应控制试验溶液的更新速率至少为每天5倍试验容器容积。 7.4.4对于半静态试验中，更换试验溶液有两种可选择的方法：
a）转移受试生物：在清洁容器中配制新的试验溶液，然后将处在极少量体积旧溶液中存活的受精
卵和幼鱼转移至另一容器中，但要避免受精卵和幼鱼暴露于空气中； b) 不转移受试生物：将受试生物体仍留在试验容器内，部分更新试验溶液（至少为2/3容器容
积)。
7.4.5半静态试验的试验溶液更新频率取决于受试物的稳定性，但推荐每天更新。若期间受试物的浓度不稳定，则应改为使用流水式试验。在试验溶液的更换操作中，应小心避免碰伤幼鱼。
8试验程序 8.1准备 8.1.1胚胎和幼体的处理 8.1.1.1胚胎：试验开始时，将受试鱼类（d-rR品系青鳞）的胚胎暴露于体积足够大的试验容器（如容积大于150mL结晶血或烧杯)中。胚胎阶段暴露采用半静态试验体系，每天更新试验溶液。 8.1.1.2幼鱼：幼鱼孵出后，如有必要，将幼鱼转移至大型试验容器内（例如烧杯或一次成型鱼缸）。在幼鱼孵出两天后开始投喂，饵料为刚孵出的丰年虫，每天2次3次饱食投喂。幼鱼阶段暴露优先选择流水试验体系，可选择半静态试验体系。 8.1.1.3半静态试验可使用烧杯或浅容器，如有必要，可在烧杯底部配备可轻轻提起的网筛。如果该容器的容积足以符合负荷要求，则不必进行胚胎和幼鱼的转移。幼鱼转移时间为孵化后2d。转移幼鱼时，不应将幼体暴露在空气中，也不应使用网具从容器中捞取（体质较强的鱼种除外）。推荐使用巴德斯吸液管移动胚胎和幼鱼。 8.1.2暴露条件 8.1.2.1持续时间
受试鱼卵受精后应尽可能快地开始试验，在胚胎开始分裂前或胚胎开始分裂后即将胚胎放入试验溶液，最迟不能晚于卵受精后8h。试验应最短持续到对照组试验鱼可自由摄食。根据选择的受试鱼种决定试验持续时间，对于推荐鱼种青鳞，暴露应持续到幼鱼孵化后21d。 8.1.2.2负荷
受精卵的数量应满足统计学要求。受精卵应随机分配到各浓度组中，每一浓度至少使用60粒受精卵，且至少应在3个平行试验容器间平均分配。在没有曝气的情况下，试验溶液中溶解氧的浓度应至少达到空气饱和度的60%。流水式测试体系中，建议24h负荷率不应超过0.5g/L，整个试验周期最大负荷率不应超过5g/L试液。
3 GB/T29764—2013
8.1.2.3光照和温度
适宜光周期为夏季16h：8h（昼：暗），冬季12h：12h（昼：夜）；适宜温度为24℃士1℃。 8.1.2.4投喂
本试验对于食物投喂要求非常严格。本质上说对于每个生命阶段应该在合适的时间提供正确的饵料，并且提供的饵料水平应足够支持受试鱼正常生长。投喂量应该不限量，但应最小剩余。剩余的饵料和粪便应及时清除，以避免废物累积。本试验受试鱼类（青筛）的详细饵料和投喂次数如表1。其中幼鱼第一次投喂时间为孵化后24h或平游时。根据试验要求，为了提高存活率和优化生长，应不断优化饵料和投喂策略。
表1不同阶段青鳞饵料组成、投喂次数和投喂量
试验阶段亲本饵料
饵料组成新孵化丰年虫、 薄片饲料新孵化丰年虫、 原生动物、轮虫新孵化丰年虫、 薄片饲料、轮虫
每次投喂量每天2%体重
投喂次数
新孵化丰年虫1次(早展）；薄片饲料上下午
各1次（时间间隔不少于6h)
新孵化幼鱼
早晨、上午和下午各1次（时间间隔不少于3h）新孵化丰年虫或轮虫上下午各1次（时间
饱食
幼鱼
饱食
间隔不少于6h)；薄片饲料每天1次
8.1.3试验浓度 8.1.3.1根据GB/T27861试验结果所得96hLCso值来确定试验浓度范围，试验最高浓度组应不大于96hLCso值或10mg/L。 8.1.3.2通常以几何级数浓度系列设置5个受试物浓度，浓度间隔倍数不超过3.2。极限试验的浓度组设置可少于5个浓度。浓度组设置少于5个时应说明理由。 8.1.3.3避免使用助溶剂，如应使用，其浓度应不大于0.1g/L或0.1mL/L。 8.1.3.4每个浓度系列设置稀释水对照组和相应的溶剂对照组。 8.2操作 8.2.1分析测量的频次 8.2.1.1试验期间，应定期测定受试物浓度。 8.2.1.2半静态试验条件下，如受试物浓度保持在设定值士20%内，在整个试验期间应对最高试验浓度和最低试验浓度组至少取样测定3次，样品为新配制的试液和即将更换前的试液。如果试验中受试物浓度不能保持在设定值的士20%内（根据受试物的稳定性数据），就应在新配制试验溶液和更新试验溶液时，对所有试验浓度取样分析，取样的次数、间隔及方式相同，除非之后状况相同（即试验期间至少平均间隔取样3次）。更换试验溶液前对每个试验浓度中的一个平行容器取样测定受试物浓度，且测定间隔不应超过7d。试验结果应以测定浓度为准。但如果整个试验期间受试物浓度保持在设定值或初始浓度值的士20%内，则结果可以设定值或起始测定值为准。 8.2.1.3流水式试验，取样方式与半静态试验中相同。若试验持续时间超过7d，第1周内应采样测定 3次。 8.2.1.4对样品进行离心或过滤（例如使用0.45μm孔径滤膜）。当两者均无法分离受试物的非生物
4 GB/T29764—2013
利用部分和生物利用部分，无需进行样品处理。 8.2.1.5试验期间，应测定所有试验容器中的溶解氧、pH值和水温，也应测定对照组和最高浓度组中一个试验容器的总硬度和盐度。溶解氧、盐度应至少每周测量1次；半静态试验应增加溶解氧的测试频率，尤其是每次试验溶液更新前和更新后，或至少一周一次。在半静态试验中，应在每次试验溶液更新的开始和结束时测定pH值，流水式试验中则至少每周测定一次pH值。硬度每次试验测定一次，温度应每天进行测量，且至少在1个试验容器中连续检测。 8.2.2观察 8.2.2.1胚胎发育阶段
在受试物暴露开始时，应尽可能准确地确认胚胎发育阶段。可选择一些清洁且有代表性的卵进行核查。 8.2.2.2孵化和存活
在试验中，每天应至少观察一次孵化和存活情况，并记录数量。为避免死亡个体（卵、胚胎或幼鱼）快速腐烂，或被其他幼鱼的活动破坏，应及时移除死亡个体。移除时要非常小心，以免碰击或损伤邻近非常娇弱而敏感的其他个体。各生命阶段的死亡标准如下：
卵：特别是在早期阶段，蛋白质凝固和（或）沉降导致透明度下降，兼有颜色上的变化（白色不透明)；
一胚胎：没有身体的运动、心脏的跳动，由半透明变为不透明；一一幼鱼：静止不动，无呼吸运动，心跳停止，中枢神经系统呈白色不透明颜色，对机械刺激无反应。
8.2.2.3异常体征
本试验推荐鱼类（d-rR品系青绨）的异常体征如下：胚胎异常特征包括围心腔水肿、出血、凝血和蓝色卵黄囊等；幼鱼异常特征包括脊椎弯曲、出血、色素沉着较少等。在试验中，应记录损伤胚胎和畸形幼鱼的数量，观察时间间隔的长短取决于试验周期和所述的异常种类。同时，应记录异常胚胎和幼鱼的自然发生率，通常情况可以近似认为是对照组中异常个体的百分数。在试验中，异常个体只有在死亡后才能被移走。 8.2.2.4异常行为
应记录的异常行为主要包括：呼吸频率加快、不协调的游动、无规律的静止和无规律摄食等。记录时间间隔的长短取决于试验周期。尽管量化该结果很难，但所观察到的结果有助于解释死亡数据，判断是否需要增加暴露时间。 8.2.2.5长度
试验结束时，建议测量个体长度，可使用标准长（即体长）或全长。如果尾鳍腐烂，应使用标准长。 通常，运行良好的试验中对照组各平行间的长度变化率小于或等于20%。 8.2.2.6体重
试验结束时，对所有存活幼鱼进行称重。干重（60℃下烘烤24h)比湿重（洁净纸吸干）好。一般情况下，对照组各平行间的重量变化系数小于或等于20%。 8.2.2.7性别比
本试验推荐的受试鱼类（d-rR品系青鳞)性别特征如下：该品系是一个具有性别连锁色素的突变品