ICS 13.300;11. 100 A 80
一
中华人民共和国国家标准
GB/T278262011
化学品 神经发育毒性试验方法 Chemicals-Test method of developmental neurotoxicity
2012-08-01实施
2011-12-30发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
中国国家标准化管理委员会 发布 GB/T27826—2011
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准与经济合作与发展组织(OECD)化学品测试指南No.426(2007年)《神经发育毒性试验》(英
文版)技术性内容一致。
本标准做了下列结构和编辑性修改
一增加了范围一章；一计量单位改成我国法定计量单位；一将OECD426原文中的“介绍”和“初步考虑”部分作为本标准引言。 本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。 本标准起草单位：中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所、上海出人境检验检疫局、中国化
工经济技术发展中心。
本标准主要起草人：刘清君、林铮、李小林、邱璐、杨挺。 GB/T 278262011
引言
1995年6月，OECD生殖和发育毒性工作组在哥本哈根召开会议，讨论对现有的OECD生殖和发育毒性的试验指南进行更新，但未包括对原有试验终点进行改进(1。工作组建议，神经发育毒性的试验指南应以美国环保署试验指南为基础(2]。1996年6月，工作组在哥本哈根召开第二次协商会议，大会提交了新神经发育毒性试验指南纲要，其中包括动物种属选择细则，染毒周期、试验周期、试验终点和结果评价标准等试验要点的详细资料。1998年美国出版了神经发育毒性危险性评价指南[3]，2000年 10月，OECD专家咨询会和ILSI风险科学研究工作组相继召开会议，并于2005年在东京召开专家协商会议[4-7]。这些会议讨论了当前试验指南所涉及的科学和技术问题。
本标准参考了OECD化学品测试指南No.426（2007年）《神经发育毒性试验》（英文版）。试验指南中关于操作、解释和试验中所用术语的资料参考了试验指导文件No.43“生殖毒性试验和评估”[8]和 No.20“神经毒性试验"[9]。
许多化学品都能够引起人类和其他动物出现神经发育毒性[10-13]。单一化学品或混合物（通称受试物)潜在的神经发育毒性测试可用于受试物的毒性特征评价。神经发育毒性研究能够反映子代在子宫内和生命早期由于暴露因素而引起的神经系统的形态改变和功能异常，并提供剂量-反应关系资料。
神经发育毒性试验可单独进行，也可合并生殖毒性和/或成年动物的神经毒性研究，或出生前发育毒性研究[14-17]。如神经发育毒性合并到其他试验中，必须确保两项试验的完整性。所有试验都应遵守当地政府和研究机构的实验动物使用准则[18]。
试验开始前，应考虑分析受试物所有的资料，包括受试物的名称、化学结构、理化特性和其他体内或体外毒性试验结果；结构相关化合物的毒理学资料以及受试物的预期使用等。这些资料既有助于试验时对人类健康保护提供必要的信息，也有助于选择合适的试验初始剂量。
= GB/T27826—2011
化学品 神经发育毒性试验方法
1范围
本标准规定了化学品啮齿类动物神经发育毒性试验的缩略语、试验原则、试验准备、试验程序、试验数据和报告。
本标准适用于检测化学品的神经发育毒性。
2缩略语
下列缩略语适用于本文件。 NOAEL：未观察到有害作用的剂量（no-observed-adverseeEffect） GD：妊娠当天（gestationday） PND：分娩当天（postnatalday） DMPT：延迟匹配状态（delayed-matching-to-position） CNS：中枢神经系统（centralnervoussystem） PNS：周围神经系统（peripheralnervoussystem） GFAP：胶质纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein）
3试验原则
3.1对妊娠期和哺乳期的动物进行染毒，不仅能评价受试物对妊娠期和哺乳期母体的影响，还能比较亲代和子代动物所出现毒作用的不同。进行神经毒性评价的子代动物应经随机选择。神经毒性评价主要包括总体的神经行为异常评价以及出生后及成年脑重和神经病理评价，神经行为异常评价包括身体发育、个体行为、运动活力、运动和感觉功能以及学习和记忆等。 3.2如果神经发育毒性试验独立进行，除基本的项目外，动物量还应满足特定的神经行为、神经病理及电生理检查需要，这些检查项目是对标准中基本检查项目的重要补充[16,19-21。当评价某些依赖经验观察的、预期的、机制/作用模式表明的某一特殊类型的神经毒性时，这些检查项目尤其有用。这些检查项目获得的资料可能对评价亲代和子代动物的毒性都有用。此外，如不改变体内实验的完整性，还可进行离体试验或体外试验。
4试验准备
4.1动物种属的选择
试验首选大鼠，也可选用其他合适的动物。但本标准中的妊娠期和哺乳期天数均是指一般大鼠；如使用其他种属动物或特殊品系的大鼠，应当选用相对应的天数。如果选择其他种属的动物，应根据相应的毒理学、药代动力学和/或其他资料说明其合理性，包括所用动物出生后神经行为发育种属特异和神经病理评价可行性。如果以往引起关注的试验，仍应考虑使用引起关注的种属和品系的动物。由于不同品系大鼠的特性不同，应确保所用动物品系有足够的繁殖能力和敏感性。选用其他种属动物检测神经发育毒性的可靠性和敏感度应具有相应的文献依据。
1 GB/T27826—2011
4.2动物饲养环境和条件 4.2.1动物房温度应在22℃士3℃。相对湿度应大于30%，最好不超过70%，除了在打扫卫生外，湿度应保持在50%～60%。采用人工昼夜，12h明暗交替。为了在黑暗期间评价（红光下）功能学和行为学的研究终点，即动物的活动是否正常，也可在交配前和试验期间改变光照循环[22]。改变光照后，应该给动物足够的时间适应新的光照循环。常规喂饲，自由饮水。报告中应列出动物饲料和饮水的类型，分析饮水和饲料中的污染物。 4.2.2动物单笼饲养或按性别群笼饲养。交配操作应在适宜的笼中进行。动物交配成功后且妊娠第 15天前，妊娠动物应转移到繁殖笼内。笼具的放置时应尽可能减少放置引起的影响。妊娠动物临近分娩时需提供合适的垫料。为防止非处理因素引起的流产，对妊娠期动物的处理应十分小心，尽可能避免外界因素干扰引起的不良情绪，如噪声的干扰。 4.3动物准备
试验所用的动物应是健康的、已经适应实验室环境的，并且之前没进行过试验的（本项试验是合并其他试验除外）。应明确受试动物的种属、品系、来源、性别、体重和年龄。对动物进行分组，编号。所有动物的体重，年龄均在试验要求动物品系的范围内，并尽可能致。每个剂量水平都应使用健康成年且未生育的雌性动物。试验中应避免发生近亲交配（同窝）。阴道内观察到阴栓和/或精子的时间为妊娠第0天（GD0）。购买的妊娠动物应保证其有足够的适应时间（2d～3d)。交配的雌性动物随机分配到试验组和对照组，保证各组分配均匀（推荐根据动物体重采用分层随机程序分组）。由同一雄性动物受精的雌性动物应均衡的分配到各试验组中。
5试验程序
5.1动物的数量和性别 5.1.1每个试验组和对照组应有足够数量的妊娠动物供染毒，确保有足够的子代动物进行神经毒性评价，建议每个剂量20窝动物。如每个剂量组都获得了足够数量的窝数，可考虑重复参差剂量（replicate andstaggered-groupdosing)设计，对于重复样品应选用恰当的统计模式进行分析。 5.1.2出生后4d之内（分娩当日为PND0），按照随机的原则剔除每窝多余的子代，使每窝子代数尽可能一致[23]。每窝子代的多少不能超过所用品系动物的正常平均值[8-12]。每窝子代雄性和雌性数尽可能相等。不能选择性的剔除子代，如按照体重的大小来剔除胎仔是不合适的。选择完后进行下一步试验前，应确定哪些用于断乳前的试验，哪些用于断乳后的试验，并对每只子代动物进行标记[24。 5.2用于功能和行为测试，脑重测量和神经病理评价的动物分配 5.2.1对于宫内及整个哺乳期染毒的动物，允许采用多种方法进行功能和行为测试，性发育、脑重和神经病理评价[25]。只要不影响整个试验的完整性，根据具体情况可以加入其他神经行为功能（如群居行为），神经化学及神经病理检查。 5.2.2在分娩第4天或第4天之后，对每个剂量组选择的子代动物进行毒作用终点评价。每一个评价项目应尽可能从每窝选择两种性别的动物，各个剂量组动物构成应尽可能一致，并且能够代表各自的性别。运动活性试验应在断乳前选择同一对雄性和雌性子代进行检查。其他试验中可采用相同或不同对的雌雄子代进行行为学试验。对于认知功能试验的子代应该分为断乳期和成年期，避免年龄和前期锻炼等混杂因素对结果的影响[26-27]。在断乳期（PND21)，不需要的子代可以实行安乐死。对子代动物处置的任何变更都应写入试验报告。对测量值的统计是以窝（动物)或每只亲代为单位，而不是以子代为单位。
2 GB/T27826—2011
子代动物断乳前和断乳后检查包括多个试验，有认知测试，病理检查等（见图1综合动物分配设计和附录A的分配举例）。断乳前和断乳后试验项目所需每个剂量组动物最少数量如表1所示。
每组约20窝动物
子代动物：各剂量组不同性别各约80只选择出生后4d或不足4d的动物进行断奶前及断奶后的检查：临床观察和动物体重(所有动物) 详细的临床观察(每组不同性别各20只) 个体行为发育（每组不同性别各20只) 运动活性(每组不同性别各20只) 性成熟(每组不同性别各20只) 运动和感觉功能(每组不同性别各10只～20只)
神经病理：PND11-22 每组不同性别各10只；脑组织浸泡或灌注固定进行神经病理检查：脑重(固定)。 可选项：其他试验每组不同性别各20只：脑重(不固定)
剩余其他不需进行神经病理检查动物。 每组不同性别各40只～50只可选项：其他试验
神经病理：PND70(试验结束时) 每组不同性别各10只：
大脑灌注固定，用于神经病理评价：
每组不同性别各10只：
脑重(不固定)
注：此图主要基于4.2的描述资料，试验动物的分配举例参见附录A。
图1子代动物功能/行为测试、神经病理检查以及脑重的试验实验流程
表1断乳前和断乳后试验项目所需每个剂量组动物最少数量
-般临床观察和体重详细的临床观察
所有动物
20只/性别[1只/（性别·窝)
脑重(固定后)PND11-22 脑重(未固定)～PND70
10只/性别（1只/窝） 10只/性别（1只/窝） 10只/性别(1只/窝） 10只/性别(1只/窝） 20只/性别（1只/窝）
神经病理学(浸泡或灌注固定)PND11-22
神经病理（灌注固定）～PND70
性成熟其他发育指标（可选）
所有动物
个体行为发育运动活力运动和感受功能学习和记忆
20只/性别[1只/(性别·窝)］ 20只/性别[1只/（性别·窝)］ 20只/性别[1只/（性别·窝)
10只/性别*（1只/窝）
根据认知功能测试的敏感度的高低，需要考虑试验可能会需要较多的动物数，例如，最多可考虑每窝动物雌雄各一只（动物的分配见附录A），动物样本安排的详细指南可见OECD指导性文件NO.438)。
3 GB/T27826—2011
5.3剂量 5.3.1试验至少设三个剂量组和一个平行对照组，各剂量水平应有合适的间隔。如果不受受试物的理化特性或生物学特点的限制，选择的最高剂量应能够诱导出一定的母体毒性，如临床症状，体重增长降低（不得超过1o%）和/或靶器官出现剂量-限定毒性（dose-limitingtoxicity）。特殊情况外（如预期人群暴露剂量可能更高），最高剂量为1000mg/（kg：d）。此外，还可以通过预试验或剂量确定试验来寻找能够引起母体出现最小毒性的最高剂量。如果在标准的发育毒性试验或预试验发现受试物有发育毒性，最高剂量水平应不能引起子代出现严重的毒性、死胎、围产期死亡或胚胎畸形，确保受试物的发育神经毒性试验能够得到有意义的结果。最低剂量应不引起任何的母体毒性和发育毒性（包括神经毒性）。 选择的从高到低的剂量水平应能够说明剂量-反应关系和NOAEL，或者该剂量接近检测的限值，用以确定基准剂量。设定最佳递减剂量水平的组间距通常为2倍～4倍。如果试验增设了第四个剂量组，选择的组间距通常较大（>10倍）。 5.3.2剂量水平的选择应考虑受试物及其结构相关物质已有的毒性数据以及代谢和毒代动力学资料。 这些资料还有助于证实染毒方案是否合理。根据染毒情况和药代动学资料，可以考虑对子代直接染毒[28-29]。在对子代直接染毒之前应充分考虑其优缺点[30]。 5.3.3对照应当是未处理组或赋形剂对照组（如配制受试物使用了赋形剂）。根据体重，所有动物都给予相同体积的受试物和赋形剂。如果染毒配制受试物使用了赋形剂或其他的添加剂应考虑：其对受试物的吸收、分布、代谢或贮留的影响；对受试物的化学特性的影响（可能改变受试物的毒作用特征）；对饲料和饮水的摄人量以及动物营养状况的影响。赋形剂不能干扰试验结果的解释，例如既不能有神经行为毒性也不能对动物的生殖和发育产生影响。对于新的赋形剂，除了一般对照组外还应设置赋形剂对照组。对照组动物的处理应当与实验组完全相同。 5.4染毒 5.4.1依据已有试验的代谢和分布资料，受试物和赋形剂的染毒方式应尽可能与潜在的人类暴露途径一致。常用的染毒方式是经口染毒（如灌胃、掺人饲料、饮水），根据受试物的特点以及预期或已知的人类暴露途径，也可选用其他染毒途径（如经皮、吸人）。应当提供染毒途径选择合理性的依据。每天尽可能在相同的时间染毒。 5.4.2尽可能根据每只动物近期的体重确定染毒量（体积）。但是在妊娠期的后1/3，调整染毒量应谨慎。如果处理组妊娠动物出现过重的毒性，对这些动物应实行安乐死。 5.4.3受试物和赋形剂染毒时间至少应该从胚胎植入（GD6)期持续到哺乳期（PND21)结束。如有证据表明适当调整染毒开始时动物的年龄，染毒持续时间和染毒频率与人类暴露的情况更加相关，则可以对染毒方案进行调整。如使用其他种属动物，为确保受试物的暴露在大脑整个发育早期（相当于出生前和出生后早期人类大脑的生长发育），应对染毒时间做适当调整。虽然应考虑受试物暴露可能引起着床前丢失，但染毒可以从妊娠当日（GD0)开始。妊娠6d(GD6)开始染毒虽然可以避免着床前丢失，但妊娠0d～6d(GD0-6）发育阶段未能暴露受试物。对于购买的妊娠动物，不可能在妊娠当天（GD0)开始染毒，因而应当在妊娠第6天(GD6)开始染毒。根据受试物的毒作用相关资料、预试验、逻辑关系制定染毒方案，包括动物断乳后如何继续染毒。动物分娩当天不染毒。通常情况下，都假定子代能够通过母乳继续暴露受试物；然而，如果没有子代继续暴露的证据，可以考虑直接对子代进行染毒。可以通过药代学信息，子代毒性或生物标志物的变化等获得子代是否暴露的证据[28]。
4 GB/T27826—2011
5.5亲代动物的观察 5.5.1所有亲代动物至少每天观察一次，观察其健康状况，包括发病和死亡。 5.5.2除了上面的观察外，在染毒期和观察期，应定期进行详细的临床观察（在妊娠染毒期和哺乳染毒期至少分别观察两次），每个剂量水平至少需观察10只妊娠动物（子代）。由不参与该试验的熟练技术人员从笼取出动物进行观察，按照标准操作规程减少对动物应激负荷和观察者的偏倚，并可能增加观察的可信度。如果可能，建议整个试验过程中由同一观察人员进行观察。 5.5.3记录出现的所有症状。记录时尽可能对所观察到症状进行量化。临床观察包括（但不限于）皮肤、毛发、眼晴、黏膜、分泌物以及自主活动（如流泪、竖毛、瞳孔大小、不正常的呼吸方式和/或张口呼吸、 异常的排尿或排便)的变化。 5.5.4记录任何与体位、活动水平（如标准活动区域的减少或增加）等有关的不正常的反应和运动协调能力的改变。记录步态（如步态不稳、共济失调），姿势（如拖尾），对操作、位置或其他环境刺激的反应性，以及阵挛性，抽搐，震额，刻板动作（如过度理毛行为、异常的头部运动、转圈），奇怪的行为（如撕咬或过度的舔甜、自残、倒退、异常叫声），以及攻击行为等。记录毒性症状，包括症状开始的时间、天数、程度以及持续时间。 5.5.5整个实验过程中动物至少每周称重一次；临近分娩或分娩当日，出生第21d（断乳）时应称重。 灌胃染毒时，妊娠动物每周称重两次，根据动物体重对染毒量做适当调整。至少应在妊娠期和哺乳期每周测量一次摄食量。如通过饮水染毒，至少每周测量一次饮水量。 5.6子代动物的观察 5.6.1所有子代动物至少每天观察一次，观察出现的毒性症状、发病和死亡。 5.6.2在染毒期和观察期，应对子代进行详细的临床观察。由不参与该试验的熟练的技术人员对子代进行观察，至少观察1只/（性别·窝），按照标准化操作规程进行操作。如果可能，建议整个试验过程中由同一观察人员进行观察。 5.6.3记录子代动物所有的毒性症状，包括症状开始的时间、天数、程度以及持续时间。 5.7子代动物身体发育指标的观察 5.7.1断乳前的发育指标（如四肢伸开、静眼、切牙萌出）的变化与体重呈高度相关性。体重可能是身体发育的最好指标。因此，只有在已有证据表明这些发育指标能提供额外信息时，才推荐测量这些指标。这些参数的评价时间见表2。根据预期的毒作用和早期测试的结果，可以增加额外的时间点或在其他发育阶段也进行评价[32]。
表2生长发育指标（功能性/行为学终点评价时间表*）
年龄青春期
终点
断乳前
成年
身体发育指标
体重和临床观察
每周1次 PND 22d PND 22d
至少每2周1次
至少每2周1次试验结束试验结束
脑重神经病理