ICS 13.300;11.100 A 80
GB
中华人民共和国国家标准
GB/T28648——2012
化学品 急性吸入毒性试验 急性毒性
分类法
Chemicals--Acute inhalation toxicity testing-Acutetoxic class method
2012-12-01实施
2012-07-31发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
发布 GB/T 28648—2012
前言
本标准按照GB/T1.1-—2009给出的规则起草。 本标准与经济合作与发展组织（OECD)化学品测试导则No.436（2009)《急性吸入毒性试验：急性
毒性分类法》（英文版）技术性内容一致。
本标准做了下列结构和编辑性修改：一增加了范围一章；一将OECDNo.436原文中的“介绍”和“初步考虑”作为本标准的引言；
计量单位改成我国法定计量单位。
一
本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。 本标准起草单位：中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所、广东出入境检验检疫局、中国化
工经济技术发展中心、中国检验检疫科学研究院。
本标准主要起草人：孙金秀、李朝林、许崇辉、林铮、刘慧智、温巧玲、潘芳、王晓兵、李晞。
I GB/T286482012
引言
OECD化学品测试导则需要随着科学技术的发展、管理规定变更的需要和动物福利方面的考虑而定期进行修订。最初的急性吸人毒性测试导则（OECD403）于1981年公布实施，并在以后进行过修订[1。由于在2001年公布实施了急性经口毒性分类法（Testguideline423，TG423)[5]才考虑编写相应的急性吸人毒性分类法（Acutetoxicclass，ATC)[2-4)。对急性吸入毒性分类法（ATC)数据资料的回顾性评估表明该方法非常适合于对化学物的毒性分级和产品标签规定的需要[6]。急性吸入毒性分类法测试导则提供的是连续操作步骤按照规定的浓度进行测试从而提供受试物毒性类别和LC5c的估测范围；死亡率是本项试验的关键终点，但是在动物处于难以忍受的疼痛、应激或正在处于濒临死亡的情况下为了减少动物的痛苦应人道的将这些动物安乐死。关于处死动物人道的终点在OECD的指导性文件19 号中7做出了规定。
对进行本项测试导则和解释可在OECD的指导性文件第39号[8]“关于急性吸入毒性试验”找到。 本标准所使用的术语定义列在了OECD的指导文件第39号内[8]。 本标准可得到受试物危害性质的信息，并可按照联合国全球化学品分类和标签管理协调制度（the
UnitedNations（UN)GloballyHarmonized System of Classification and Labelling of Chemicals, GHS)的化学品急性毒性标准进行分级[9]。在需要对急性吸人LC5o的点估计值和浓度-反应进行分析时，按照OECD403t1是比较合适的。更多需要选择的测试导则可在OECD指导文件39号18]文中找到。本标准并不是特定为测试难溶的同分异构物，或纤维材料，或纳米材料而制定的。
在按照本标准进行试验之前关于受试物的所有信息资料，包括那些支持不需要进行附加试验的已有的试验报告，以尽可能减少试验所用的动物数量。对于那些可以帮助选择最合适的动物种属、品系、 性别、暴露方式和最佳的暴露浓度等信息，如特有的性状、化学结构、理化性质等；任何体外和体内的试验结果；预期用途和人体潜在的暴露情况；结构-活性资料和与结构上相关的化学物的毒理学资料；本标准规定：不以腐蚀性或严重的刺激性引起严厉的疼痛和应激的浓度来进行试验（见指导文件39号)[8]。
Ⅱ GB/T28648—2012
化学品急性吸入毒性试验 急性毒性
分类法
1范围
本标准规定了化学品急性吸人毒性的急性毒性分类试验方法的试验原则、试验方法、数据和报告。 本标准适用于化学品急性吸人毒性的急性毒性分类。
2试验原则
本试验采用分步操作的方法，观察试验动物暴露4h的反应，从而得到满足对受试物急性吸入毒性
等级进行分类的信息。为了特殊管理目的也可采用其他暴露时限（不是4h)的试验。每步试验使用每性别3只动物在确定的浓度下进行暴露试验。根据动物死亡和/或濒死状态，有时只进行2步试验操作就可以对受试物的急性吸人毒性类别做出判断。如果有证据表明某种性别的动物比另外一种动物的敏感性要高时，可以只使用敏感性别动物进行试验。前面一步操作的试验结果决定着下一步试验操作：
a）无需进行下一步试验； b）每性别3只动物；或 c) 只使用6只敏感性别的动物。方法是每个试验浓度组使用6只敏感性别的动物，性别不限，以
估测的毒性类别界限范围值中较低的浓度来进行试验。
应人道地处死濒临死亡的、处于难以忍受疼痛的和严重持久痛苦的动物，结果按照试验死亡进行统计。对动物的濒死、严重的痛苦做出人道处死的标准，以及预测不可避免死亡的确认方法，在OECD指导文件19号“人道终点的辨认、评价和应用”内[7。
3试验方法
3.1方法描述 3.1.1动物种属的选择
应使用健康年轻、实验室中常用的种属动物进行试验。首选大鼠，如使用其他动物应进行论证，说
明理由和依据。
3.1.2动物的准备
雌性动物应是未经产的、未娠。要保证每步试验暴露时的鼠龄在8周～12周：体重应控制在上
一步骤相同鼠龄、相同性别动物平均体重的20%之内。采用随机选择原则，并对每只动物做出标记。 在进行试验之前至少要在笼内饲养5d以适应实验室饲养条件。试验前还需在试验设备中进行短期的适应训练，以减少因为进入新的设备环境造成的应激 3.1.3饲养条件
实验动物暴露前和暴露结束后，室内温度应在22℃士3℃。相对湿度30%～70%，但试验暴露期间以水为载体时很难做到。
1 GB/T28648—2012
实验动物暴露结束后按性别、浓度分笼饲养，但是每笼动物的数量不能妨碍对每只实验动物的观察，并应减少由于同种相残和相互撕咬而造成实验动物信息的丢失。以口-鼻式装置暴露时，需将动物放人固定管内使其适应固定管的环境。固定管不能过度的增加动物体力、热量和活动的负荷。限制固定可以影响动物的生理终点如体温（过热）和/或每分钟动物呼吸量。如果有资料表明这些改变没有达到可感觉到的程度，就不一定需要预先在固定管内进行适应操作。整体暴露气溶胶的动物暴露期间需各自相隔互不接触，防止柜体内动物的相互趴卧造成被毛对气溶胶的过滤作用。给予常规检验合格的饲料（暴露期间禁食），自由饮水。采用人工照明，每12h明暗交替。 3.1.4吸入染毒装置
要根据受试物的性质和试验目的来选择吸人染毒方式。首选的染毒方式是口-鼻式（nose-only)染毒，是指仅头部暴露、鼻部暴露和鼻口部暴露三种吸人模式。受试物是液体、固态气溶胶和能产生气溶胶的蒸气时，首选口-鼻式暴露方式。如证实整体暴露方式较好地满足特殊试验目的时还是可以使用的，但是应在试验报告中进行论述说明。为了保证整体染毒时柜体内空气中受试物的稳定性实验动物的总体积不应超过染毒柜总容积的5%。在OECD指导文件39号[8]中对口-鼻式和整体暴露技术的原理和各自的优缺点进行了论述。 3.2暴露条件 3.2.1染毒浓度 3.2.1.1推荐暴露吸人时间为固定的4h，但需除去达到浓度稳定平衡所需时间。根据特殊需要也可采用其他的暴露时限，但是需在试验报告中进行论述。整体暴露时的动物要各自相隔互不接触，防止架毒柜内其他动物的理毛行为经口摄人受试物。吸人暴露期间需要禁食。整体暴露时可提供饮水。 3.2.1.2动物吸人暴露的受试物是气体、蒸气、气溶胶或是它们的混合物。试验时将受试物制备成的何种物态（气溶胶、粉尘）取决于受试物的理化性质、设定的浓度，和/或按照实际加工使用期间的物理状态等。吸湿性的及会发生化学反应的受试物试验中需保证所用空气干燥。需注意避免使用发生爆炸的浓度进行试验。 3.2.2颗粒粒径的分布
对所有的气溶胶和可能形成气溶胶的蒸气都需测定颗粒粒径的大小。为了使整个呼吸道都能暴露受试物，推荐的气溶胶颗粒的半数质量空气动力学直径（Massmedianaerodynamicdiameters，MMAD）为1μm～4μm，其几何标准差为1.5～3.08,13-14]。需尽量达到这个标准，实在达不到时需由专家做出评判。例如，金属烟尘比本标准的粒径要小，但是带电的粒子、纤维和吸湿性受试物（在呼吸道湿性环境下其粒径增加)可超过这个标准。 3.2.3用载体对受试物的配制
为了制备受试物在试验空气中合适的浓度和粒径大小需要使用载体溶剂。作为--条规定首选载体是水。颗粒物需要机械加工达到要求的粒径大小，但要注意加工中是否引起受试物的分解和变性。如机械加工改变了受试物组成成分（由于过度摩擦产生高温），受试物的组成要经过检验分析进行确认。 需严格注意不要污染受试物。对不能形成可吸入性的、非易成为粉末的颗粒材料不需要进行试验。磨损试验是用来证明操作这些颗粒物材料时会不会产生呼吸性颗粒物。如果经磨损试验证实可产生呼吸性颗粒物，该被加工的材料应当进行吸人毒性试验。 3.2.4对照动物
不需要设立同步阴性（空气)对照。即便制备试验空气的载体不是水，也只有在没有载体的历史数
2 GB/T28648—2012
据的情况下才设立载体对照组。如果所用载体制备的受试物没有引起毒性，说明至少在试验的浓度下载体是没有毒性的，所以不需要设立载体对照组。 3.3暴露条件的监测 3.3.1染毒装置内气流
通过染毒柜（装置）的气流速率需产格控制，可连续在线监测记录或每次暴露期间至少每小时监测
记录一次。试验所用空气中受试物浓度（或其稳定性）监测数据是对染毒系统中各个动力学参数作用的综合结果，因此这些数据可提供控制制备动态空气设备相关参数的间接方法。在口-鼻式染毒时通过染毒系统的试验气体的气流动力不足时，需注意动物的在染毒装置内发生重复吸入。已有确定在所选定的操作条件下不会发生重复吸人的方法[8.15]。氧气的浓度至少为19%；二氧化碳的浓度不超过1%。 如果证实确实不能达到这个标准，需要测定试验空气中氧气和二氧化碳的浓度。 3.3.2染毒装置柜体内温度和相对湿度
染毒柜内温度维持在22℃士3℃。口-鼻式和整体暴露都需监测记录动物呼吸带的相对湿度，在吸人染毒的4h之内至少3次；吸人染毒暴露期限较短的试验可以每小时监测记录1次。理想的相对湿度需维持在30%～70%；但是有时很难达到（受试物的水制备物），有时是受试物与测定方法发生干扰而无法测定。 3.3.3受试物 3.3.3.1计算浓度
无论何时都尽量计算和记录染毒暴露柜空气中的计算浓度。计算浓度是指制备产生的受试物的量除以通过染毒系统的空气总体积得到的参数。虽然计算浓度不是用来描述动物暴露特征，但是可通过计算浓度与实际浓度进行比较可以得到试验系统制备效率的指征，从而可发现制备染毒空气过程中存在的问题。 3.3.3.2实际浓度 3.3.3.2.1实际浓度是吸人染毒柜内动物呼吸带的受试物的浓度，可以通过特异性的方法（如采用吸附或化学反应的原理直接采样，然后进行分析），或是通过非特异性的方法如滤膜增重法来得到。单一成分的粉末、低挥发性液体的气溶胶才能使用增重法，同时还需要专门预试验的支持。对多成分的粉末气溶胶也可以用增重分析法测量，但是这需要证实所制备的空气与最初受试物的组成成分相似。如果没有这样的资料，需要在试验期间按照规定的时间间隔对制备产生的空气进行再分析（理想的是染毒柜中的空气）。对可挥发的或易升华的气溶胶，需证实所用方法能收集到所有物相的受试物。需在试验报告中报告靶浓度、计算浓度和实际浓度，但只有实际浓度用来计算致死浓度值。 3.3.3.2.2应使用同一批试验受试物。技术可行时尽可能将试验样品保存在能维持纯度、均匀性和稳定性的条件下。开始试验前对受试物的特征有充分的了解和描述，如纯度、鉴别特征和鉴定出来的污染物和杂质。这可用以下参数来证实，如保留时间、相对峰面积和通过质谱、气相色谱或其他的检测方法得到的分子量，不限于这些。虽然受试物样品的特征鉴别不是实验室的责任，实验室还是需要对委托方提供的受试物进行简单有限的描述（如颜色、物理状态等）。 3.3.3.2.3需尽可能的保持染毒空气成分稳定，可采用分析方法连续或间隔采样监测。间隔采样时，吸人染毒4h的试验至少采样2次。如果由于系统内染毒空气流量过低所限，或染毒浓度太低需采集较大的空气样品时而不能完全满足连续或间隔采样量的要求，可在整个暴露期内只采集一个样品。如果样品与样品之间出现明显波动，进行下一个浓度试验时需在暴露期间采集4个样品进行分析。染毒
3 GB/T28648—2012
试验动物暴露水平是：气体20000mL/m；蒸气20mg/L；粉尘/雾5mg/L（如果能做成）。受试物制备成气溶胶时，需粒径的大小达到可呼吸性粒子的大小（如MMAD为1μm～4μm）。绝大部分的受试物都能在2mg/L的浓度水平进行试验。要进行高于2mg/L浓度水平的气溶胶试验，受试物应能够制备成可呼吸性粒子大小（更多的信息参见指导文件39号）8)。从动物福利来考虑，GHS不主张超过限度浓度的试验9。 3.4.2.3只在有可能直接涉及到人类健康9需要的情况下才进行GHS中第5类物质浓度水平的试验，并需在试验报告中论述理由。对潜在爆炸性受试物试验设计时要认真研究避免引起发生爆炸的条件出现。为了避免不必要的使用动物，开始限度试验前需染毒系统不放置动物的预试验以确认染毒条件是否能达到限度试验的水平。 3.4.3观察 3.4.3.1暴露期间要对实验动物经常进行临床观察。暴露染毒结束后的当日至少要观察2次，还可根据动物对染毒的反应还可增加观察次数；此后的14d内至少每日观察1次。观察期期限的长短不是固定不变的，需要根据临床体征出现的性质、时间和体征消失的长短来决定。毒性体征出现和消失的时间是十分重要的，尤其是注意是否存在毒性体征延迟出现的倾向。对每只动物的所有的观察都要分别作系统的记录。 3.4.3.2对处于濒死的动物和表现出严重的疼痛和/或持续的严重痛苦的动物从动物福利考虑要人道的处死。对最初出现的微弱的毒性体征和由于暴露操作引起的短暂的呼吸道的异常改变等临床体征要认真分析区别，不要错误认为这些都是染毒处理引起的毒性作用。要按照列在人道观察终点的指南文件中“人道终点”的原则和标准进行操作汀。对人道处死的或发现已经死亡的动物处死和死亡时间要尽可能的准确的记录。笼外观察包括动物皮肤和被毛、眼和粘膜、呼吸、循环和中枢神经系统的改变，以及身体活动和行为方式等变化。尽可能的注意局部作用与系统作用之间的任何差别。关注点是对颤动、 抽搐、流涎、腹泻、嗜睡、睡眠和昏迷。测定直肠温度可辨别出是否存在因处理或在固定管内过度的限制造成的反射性呼吸过缓、体温过热提供有力的支持。 3.4.4体重
进人实验室适应环境期间每只至少要称量一次体重；暴露当日的开始试验前（第0天）、暴露后的 1d、3d、7d(此后每周一次）、死亡时和染毒后超过1d以后人道处死的动物都要称量每只动物的体重。 体重已经作为界定毒性作用的指标，并且规定体重持续低于试验前体重的20%要给予密切观察。试验结束时存活动物称量体重后并人道地处死。 3.4.5病理学
所有实验动物，包括试验期间死亡的、人道处死的动物和动物福利考虑从试验队列中退出的，都需进行大体解剖检查。如果发现动物死亡后不能立即进行解剖检查，将死亡动物放人冰箱冷藏箱内（不是冷冻)低温存放，以减少动物户体的分解。大体尸检应在死亡后1d～2d进行。每只动物大体解剖所见的病理学改变都记录，特别注意呼吸道出现的任何变化。辅助的其他检查，包括可能对试验结果做出解释的所设计检查，如测定存活大鼠的肺脏重量或者对呼吸道进行显微检查提供受试物刺激性的证据等。检查的器官涉及到染毒后存活24h以上的动物出现大体解改变的器官、或者已知或估计可能受到影响的器官。全呼吸道的显微组织学检查对鉴定出是否与水发生反应的受试物，如酸和吸湿性的受试物非常有价值的信息。
4数据和试验报告
4.1数据
需提供每只动物的体重、大体解剖检查所见的全部资料。临床观察的数据需要总结成表格的形式：
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