Q/SY
中国石油天然气集团有限公司企业标准
Q/SY17757—2021
油藏微生物检测方法 培养计数法
Testing method for reservoir microorganisms-
Culture counting method
2021—09—07发布
2021－11—15实施
中国石油天然气集团有限公司 发布 Q/SY17757—2021
目 次
前言
范围规范性引用文件
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3 术语和定义
仪器设备试剂或材料 6 样品要求样品检测 8 细菌计数方法 9 精密度 10 结果分析 11 QHSE要求附录A（规范性） 水样中细菌的稀释接种附录B（规范性） 细菌计数方法
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4 Q/SY 17757—2021
前言
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草，
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国石油天然气集团有限公司标准化委员会油田化学剂及材料专业标准化直属工作组提
出并归口。
本文件起草单位：勘探开发研究院、长庆油田分公司、华油集团公司、中国石油大学（北京）。 本文件主要起草人：崔庆锋，修建龙，徐飞艳，王永宏，李文宏，王洪关，万云洋，王梦颖。俞理
黄立信、马原栋，伊丽娜、魏小芳、许颖、王璐、张永强、张晓斌、向中远，张英、陈振波、冯春艳、 陈践发。周新宇、穆红梅。
I Q/SY17757—2021
油藏微生物检测方法 培养计数法
1范围
本文件规定了油藏微生物的检测方法 培养计数法的采样方法，样品检测，细菌计数方法，结果分析和QHSE要求。
本文件适用于油藏采出液、微生物菌被中的烃氧化菌、腐生菌、厌氧发酵菌、硫酸盐还原菌、硝酸盐还原菌，产甲烷菌、铁细菌。铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的菌数分析，可应用于油藏开展微生物驱油试验的微生物资源评价，微生物驱油室内实验和现场试验的生化指标检测及现场注人微生物菌液的质量控制。
规范性引用文件
卫
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件，不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
SY/T0532—2012油田注人水细菌分析方法 绝迹稀释法 SY/T6888—2012微生物驱油技术规范
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
油藏微生物 reservoir microorganisms 能在油藏环境中生长，紫殖和代谢，且其生物活动对原油，地层水组分及油田生产有影响的微
生物。
4仪器设备
本文件用到的主要仪器设备有 a）冰箱：控温范围-20℃～4℃，控温精度在±0.5℃以内 b）恒温培养箱：控温范围30℃～60℃，控温精度在±0.5℃以内： C）气相色谱仪：气相色谱配有PlotQ色谱柱及FID检测器： d）生物显微镜：放大倍数100～1000倍； e）紫外灯：365mm f）高压灭菌锅：灭菌温度范围63℃～121℃，控温精度在±0.5℃以内： g）高速离心机：15000r/min或以上： h）真空泵：正压力小于0.08MPa，抽气速度不小于20L/min。 Q/SY 17757—2021
5试剂或材料
本文件用到的主要试剂或材料有： a）75%酒精溶液及酒精棉球， b）1mL无菌注射器。 c）格里斯试剂。 d）二苯胺试剂。 警告：二苯胺试剂易挥发。有毒。可燃。具刺激性，可损害神经系统，心血管系统及血液系统。 e）20%甘油。 f）细菌测试瓶：腐生菌测试瓶、烃氧化菌测试瓶、厌氧发酵菌测试瓶、硫酸盐还原菌测试瓶
硝酸盐还原菌测试瓶。产甲烷菌测试瓶。铁细菌测试瓶。铜绿假单胞菌测试瓶，枯草芽孢杆菌测试瓶。测试瓶应符合SY/T0532—2012或SY/T6888—2012的要求。
6样品要求
6.1采集的水样应具有代表性，取样全程应无新增细菌，不得污染或染人杂菌。 6.2采样总量为1L～5L，等量分装于两个取样容器内，密封并贴好标签。 6.3样品的标签上应注明取样地点。部位、取样方式。取样日期。取样人：必要时注明分析项目及其他需要说明的内容。 6.4两份样品一份作检验用，另一份作复检用。复检样品采取高速离心机3000g离心10min或真空泵抽滤得到菌体，溶于20%甘油溶液后冷冻保藏在一20℃C冰箱，并至少保存3个月：复检时将冷冻样品放人28C的水浴中快速解冻后进行检测。 6.5取样后应尽快在现场完成检测，如不能在现场立即检测，样品必须保藏在0℃～4℃冰箱内：并在24h之内完成检测。
7样品检测
7.1按照先厌氧后好氧的次序，即按照产甲烷菌MPB、硫酸盐还原菌SRB、厌氧发酵菌FMB、烃氧化菌HOB，腐生菌TGB，硝酸盐还原菌NRB，铁细菌IB，铜绿假单胞菌PMA，枯草芽孢杆菌XXG 的次序依次进行。 7.2水样中细菌的稀释接种应符合附录A的要求 7.3将7.2中稀释接种后的细菌测试瓶放人恒温培养箱中培养，培养箱温度设置为油藏温度。必要时将另一份7.2中稀释接种的细菌测试瓶培养于28C的恒温培养箱，以便于不同油藏温度区块样品的结果对比。 7.4培养结束后。判断各类细菌测试瓶的阳性情况：
a）产甲烷菌培养14d～21d后，用气相色谱仪测定各稀释管中甲烷的含量，检出甲烷的即表示
有产甲烷菌生长： b）硫酸盐还原菌培养7d21d，测试瓶中液体变为黑色，即表示有硫酸盐还原菌生长： c）厌氧发酵菌培养14d后摇匀培养基，混浊或变色即表示有厌氧发醇菌生长： d）烃氧化菌培养14d后，以油水界面存在的菌膜或液蜡乳化结合生物显微镜镜检来判断细菌的
生长，运动性强的细菌也可表现为培养基混浊 e）腐生菌培养7d。测试瓶中液体混浊或变色，即表示有腐生菌生长：
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f）硝酸盐还原菌培养7d一14d后，向培养液中滴加格里斯试剂，变红，或不变色再滴加二苯胺
试剂（二苯胺0.5g溶解于100mL浓硫酸，后加人20mL蒸馏水稀释），仍不变色，即表示有硝酸盐还原菌生长：
g）铁细菌培养7d～14d。测试瓶中液体产生浑浊或红棕色胶状物，即表示有铁细菌生长： h铜绿假单胞菌培养1d～7d，测试瓶中液体混浊或变色，或于黑暗处紫外灯365nm有荧光，
即表示有铜绿假单胞菌生长： i）枯草芽孢杆菌培养1d～7d。测试瓶中液体混浊或变色，即表示有枯草芽孢杆菌生长。
8细菌计数方法
细菌计数方法按附录B执行。
精密度
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同一操作者，在同一实验室按本方法规定的步骤，在连续时间内，对同一样品进行重复测定，如样品细菌含量高（107及以上） 所得结果允许误差不得大于10°：如样品浓度低（10°以下），所得结果允许误差不得大于10″
10 结果分析
根据需要给出细菌含量范围或准确的细菌计数
11QHSE要求
检测后的油水样品、细菌测试瓶不得随意排放，丢弃。应集中回收，高压灭菌锅灭菌后统一处理。 二苯胺试剂有毒、有刺激性，使用时应加注意，使用后废液统一上交 集中处理。 Q/SY 17757—2021
附录A （规范性）
水样中细菌的稀释接种
A.1视待测水样中的菌数多少，取68个细菌测试瓶，并按1#、2*、、6*（或8）进行依次编号。 A.2用小刀去除细菌测试瓶铝盖中心部分，用酒精棉球消毒胶塞。 A.3取样前将样品摇匀，用无菌注射器针头伸到原油以下的待测水样中取1mL水样，注入1瓶，充分振荡，该瓶稀释浓度为10-1。 A.4另取一只无菌注射器从1"细菌测试瓶内取1mL水样注入2”瓶中，充分振荡，该瓶稀释浓度为10-2。 A.5另取一只无菌注射器从2#细菌测试瓶内取1mL水样注人3#瓶中，充分振荡，该瓶稀释浓度为 10-3 A.6参照A.3、A.4和A.5的操作方式，将待测水样稀释接种至10-6（或10-"）。 A.7依据检测使用的单管法，双管法或三管法，各稀释浓度做1个、2个或3个重复测定细菌测试瓶。并留下1个细菌测试瓶作为空白对照。
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