ICS 75-010 E11
Q/SH
中国石油化工集团有限公司企业标准
Q/SH 0757—2019
地表土壤中油气指示微生物检测
平板菌落计数法
Detection of oil and gas indicating microorganisms in surface soils
plate colony-counting method
2020-01-01实施
2019-08-20 发布
中国石油化工集团有限公司发布 Q/SH0757—2019
目 次
前言
·II
范围 2 规范性引用文件 3 术语、定义和缩略语 4 方法原理 5 仪器和设备· 6 材料和试剂
I
2
样品采集与保存 8 实验准备 9 实验步骤
7
. 3
. 3
4
质量要求· 附录A（资料性附录） 培养基成分
10
-
- Q/SH0757—2019
前言
本标准依据GB/T1.1一2009《标准化工作导则 」第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由中国石油化工股份有限公司油田勘探开发事业部提出。 本标准由中国石油化工集团有限公司科技部归口。 本标准负责起草单位：中国石油化工股份有限公司石油勘探开发研究院无锡石油地质研究所。 本标准主要起草人：杨帆、许科伟、宁丽荣、顾磊、卢丽、汤玉平、李武。 本标准为首次发布。
I Q/SH0757—2019
地表土壤中油气指示微生物检测 平板菌落计数法
1范围
本标准规定了地表土壤样品中对油气藏分布有指示作用的微生物平板菌落计数检测的方法原理、仪器和设备、材料和试剂、样品采集与保存、实验准备、实验步骤和质量要求。
本标准适用于近地表土壤样品（含海底沉积物）中油气指示微生物数量的测定
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备 GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度） 第2部分：确定标准测量方法重复性
与再现性的基本方法
GB/T 6682 2分析实验室用水规格和试验方法
3术语、定义和缩略语
下列术语、定义和缩略语适用于本文件。
3.1术语和定义 3.1.1
油气指示微生物oilandgasindicatingmicroorganisms 地表土壤中以轻烃为碳源，对下伏油气藏的分布有指示意义的一类专性微生物。
3.1.2
平板菌落计数法platecolony-countingmethod 将土壤稀释液涂布在琼脂培养基上，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，通过统计平板上生
长的菌落数来获取土壤样品中微生物数量信息的检测方法。 3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。 BOB 丁烷氧化菌 MOB ：甲烷氧化菌
4方法原理
利用琼脂培养基对土壤样品中的专性微生物进行培养，使其在一定条件下繁殖发育形成菌落，通过检测培养基上的菌落数获得土壤样品（含海底沉积物）中专性微生物的数量信息
1 Q/SH0757—2019 5 仪器和设备
5.1 仪器包括：
a) 电子天平：感量为0.01g； b） pH计：精度为0.1级； c) 菌落计数器：分辨率不小于0.08mm，菌落统计速度大于300个/s。
5.2 设备包括：
a) 移液器：量程10mL，5mL，200μL； b) 恒温水浴箱：50℃土1℃； c) 生化培养箱：0℃～50℃（土1℃）； d) 工作台：无菌工作台； e) 紫外灯：功率不大于40W； f) 电热干燥箱：温度范围10℃～250℃（土1℃）； g) 冷藏箱：0℃~4℃。 h) 高压蒸汽灭菌锅，工作压力不大于0.35MPa，工作温度不大于142℃； i) 涡旋振荡器：振荡速度0r/min~3000r/min。
67 材料和试剂
6. 1 材料包括：
a) 移液器枪头：10mL、5mL、200μL； b) 烧杯：200mL； c) 锥形瓶：1000mL； d) 塑料离心管：50mL； e) 平板：一次性塑料无菌，直径为90mm； f) 玻璃三角涂布棒：长度15cm～20cm； g) 玻璃棒：长度30cm40cm； h) 酒精灯； i) 牛皮纸； j) 医用纱布； k) 无菌采样袋：100mL、200mL； 1) 棉线绳：直径为3mm； m) 玻璃珠：直径为5mm。
6. 2 试剂包括：
a) 实验室用水，符合GB/T6682要求； b) 去离子水：无菌； c) 氯化钠：分析纯； d) 琼脂粉：生化试剂； e) 盐酸：浓度为1mol/L； f) 氢氧化钠：浓度为1mol/L； g) 甲烷：纯度99%； h) 丁烷：纯度99%。
2 Q/SH0757—2019
7样品采集与保存
7.1采集近地表30cm以下的土壤样品，去除瓦砾、碎石、草根等杂质的土壤样品约200g，装入无菌采样袋，置于4℃冷藏箱保存。 7.2土壤样品应在一个月之内完成检测。
8实验准备
8.1清洗灭菌 8.1.1清洁后的无菌工作台，用紫外灯灭菌不少于30min。 8.1.2将清洗并烘干后的锥形瓶、烧杯和玻璃三角涂布棒用牛皮纸包装，置于电热干燥箱中不低于 160℃灭菌2h。 8.1.3将清洗并烘干后的塑料离心管30个～50个一组，用牛皮纸包装，置于高压蒸汽灭菌锅不低于 121℃灭菌不少于20min。 8.1.4将3种型号的移液器枪头装入相应枪头盒，用牛皮纸包装，置于高压蒸汽灭菌锅不低于121℃ 灭菌20min。 8.1.5将清洗并烘干的玻璃珠装入200mL烧杯，用8层医用纱布盖住烧杯口，并用牛皮纸和棉线绳包扎紧，置于高压蒸汽灭菌锅不低于121℃灭菌20min。 8.1.6将8.1.2、8.1.3、8.1.4、8.1.5中灭菌的耗材取出后置于电热干燥箱中不低于60℃烘干，冷却备用。 8.2盐水制备 8.2.1 称取8.5g氯化钠（NaCI），溶解在装有1000mL去离子水的锥形瓶中，用玻璃棒搅拌使其充分溶解。 8.2.2用8层医用纱布盖住瓶口，并用牛皮纸和棉线绳包扎紧。 8.2.3将锥形瓶置于高压蒸汽灭菌锅于不低于121℃高压灭菌20min，冷却后备用。 8.3琼脂培养基制备 8.3.1根据检测指标需求，将附录A中培养基成分15mL～20mL溶解于装有1000mL去离子水的锥形瓶中，调节pH为7.0～7.2（用NaOH溶液和HCI溶液调节），用玻璃棒充分搅拌混匀，用8层医用纱布盖住瓶口，并用牛皮纸和棉线绳包扎紧。 8.3.2置于高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20min，降温到50℃～55℃，摇匀后倾注平板。如不能立即倾注平板，应将融化的培养基于50℃土1℃水浴保温，且不应超过6h。 8.3.3制备好的平板琼脂培养基冷却后，置于0℃～4℃冷藏箱中备用；若超过3天，应重新制备。 8.4土壤匀液制备 8.4.1用电子天平称取5g土壤样品放入50mL塑料离心管中，用移液枪加入20mL无菌盐水。 8.4.2向离心管中加入7颗～8颗玻璃珠，用涡旋振荡器振荡10min，使块状沉淀全部分散，制成稀释度为1:5的土壤匀液。 8.5土壤稀释液制备
3 Q/SH0757—2019 8.5.1用10mL移液枪（10mL枪头）准确吸取稀释度为1:5的土壤匀液10mL，注入装有10mL无菌盐水的离心管中，制成稀释度为1:10的土壤稀释液。 8.5.2用5mL移液枪（5mL枪头）准确吸取稀释度为1:10的土壤稀释液2mL，注入装有18mL无菌盐水的离心管中，制成稀释度为1:100的土壤稀释液。 8.5.3用5mL移液枪（5mL枪头）准确吸取稀释度为1:100的土壤稀释液2mL，注入装有18mL无菌盐水的离心管中，制成稀释度为1:1000的土壤稀释液。 8.5.4按照8.5.3的方法将土壤稀释液制成10倍递增稀释度，如1:104、1:105、1:10°.，每递增一个稀释度，换用一个新的枪头。 8.5.5每次移液前，应对离心管中的样品进行振荡混匀，振荡时间为6s～8s。吸取样品时，枪头插入液面以下不宜超过1.5cm，且枪头不应碰到管壁。
9 实验步骤
9.1样品接种 9.1.1每一个土壤样品，应选择合适的两个连续稀释度的土壤稀释液进行平板接种，每个稀释度做两个平板。 9.1.2用200μL量程移液枪（200μL枪头）吸取100μL相应稀释度的土壤稀释液，注到平板中琼脂培养基上，用三角涂布棒涂匀。吸取样品按照8.5.5进行操作。 9.1.3涂布棒在每次使用之前应用酒精棉擦拭并用酒精灯灼烧灭菌不少于10s，冷却后使用。 9.1.4取另一组平板不接种土壤稀释液，作为空白。 9.1.5对平板进行编号，记录样号、接种浓度、培养菌种等。 9.2菌落培养 9.2.1涂布接种完成后，将平板水平静置约30min，之后将其倒置于充入培养气体的密闭培养箱中， 30℃恒温培养60h土2h。 9.2.2MOB的培养充入甲烷气体，使培养箱中甲烷浓度保持在10%左右；BOB的培养充入丁烷气体，使培养箱中丁烷浓度保持在10%左右。 9.3菌落计数 9.3.1菌落培养结束后，应立即计数每个平板上的菌落数。如果不能立即计数，应将平板存放于4℃ 冷藏箱，且不应超过24h。 9.3.2进行平板菌落计数时，直接采用菌落计数器进行计数。按30个～300个菌落计数规则计算平板上的菌落数。 9.3.3若空白平板出现菌落，则表明实验过程中有污染，本次实验无效。 9.3.4在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。 9.3.5计数时，选择平均数在30个～300个之间的稀释度乘以稀释倍数报告菌落数（表1，样品1）。 9.3.6若两个稀释度的菌落数均在30个～300个之间，由两者之比决定，比值小于等于2，报告取平均数（表1，样品2），比值大于2报告其中较小数字（表1，样品3）。 9.3.7若两个稀释度的菌落数均大于300个，按稀释度最高平均菌落数乘以稀释度报告菌落数（表1，样品4） 9.3.8若两个稀释度的菌落数均小于30个，按稀释度最低平均菌落数乘以稀释度报告菌落数（表1，样品5）。 4