2012年4月
过程工程学报
The Chinese Jourmal of Process Engineering
Vol.12 No.2 Apr.2012
以L-谷氨酰胺-锌（II）配合物为供体酶法制备茶氨酸及其反应机理
胡国梅，姚忠，王浩琦，周治，熊强，徐虹，韦萍
(南京工业大学食品与轻工学院，江苏南京210009)
摘要：针对酶法合成茶氨酸中存在的自转肽刷反应，合成了L-谷氨酰胺-锌(II)配合物Zn(GIn)2，以其为供体、乙胺为受体、枯草芽孢杆菌B.subtilisGGT为催化剂，酶法制备茶氨酸。结果表明，Zn(Gln)在反应主体相稳定性良好以Zn(Gln)为供体可有效抑制自转肽副反应；B.subtilisGGT对Zn(Gln)和Gln的亲和力常数分别为0.53mmol/L和 1.01mmol/L.在Zn(Gln)6.0mmol/L、乙胺200mmol/L及GGT0.5U/mL条件下，经37C反应2h，茶氨酸浓度最高可达7.38mmol/L，较以Gln为供体时提高了14.42%.
关键词：L-茶氨酸：-谷氨酰转肽醇：L-谷氨酰胺-锌(II)配合物：酶法合成；自转肽中图分类号：Q556.3
文献标识码：A
1前言
文章编号：1009606X(2012)02028305
二价金属配合物作为供体参与GGT反应的可行性；同
L-茶氨酸(Theanine)是茶叶的特征氨基酸，也是茶叶的主要呈味物质之一，具有抑制神经活动、影响脑内神经传达物质多巴胺的代谢和释放、保护神经细胞、降血压及增强抗癌药物的疗效等独特的生理功能"
目前，茶氨酸的制备方法主要有提取法(2.3)、微生物发酵法2]、化学合成法4和酶法[3，其中利用-谷氨酰转肽酶[y-Gutamyltranspeptidas，GGT,E.C.2.3.2.2]的酰基转移活性制备茶氨酸的方法极具产业化应用前景 Suzuki等3以E.coliK-12GGT为催化剂、L-谷氨酰胺(Gln)为-谷氨酰供体、乙胺为受体，一步法合成了L-茶氨酸，谷氨酰胺转化率为60%.国内学者[6-14]在构建 GGT工程菌及法合成茶氨酸方面也开展了大量研究但由于目前研究的反应体系均是以Gln和乙胺为反应物，而供体Gln分子中存在亲核性很强的α-NH2，反应过程中不可避免地存在强烈的自转肽副反应，不仅影响了供体转化率，同时也增加了产物后提取的难度[3]
针对上述问题，本课题组15)提出了一种以L-谷氮酰胺-铜(II)[Cu(Gln)2]配合物为供体、乙胺盐酸盐为受体的L-茶氨酸酶法合成新路线，有效抑制了自转肽副反应，产物得率和供体转化率大幅提高，但其反应机理尚不明确.同时，由于Cu*存在安全性问间题，在食品、药品中的使用受到严格限制，因此垂需寻找安全性更高的替代物
本研究在上述工作基础上合成了Zn(II)-L-谷氨酰胺配合物Zn(Gln)2，考察了其在GGT反应体系中的稳定性和反应性，探讨除Cu(Gln)外，其他L-谷氨酰胺-
时通过质谱分析反应机理，为进一步丰富GGT的酶学研究、拓展酶法合成茶氨酸技术提供理论和技术支撑
2实验 2.1材料与试剂
L-茶氨酸标准品(纯度>98%，德国Sigma公司)， Gln(色谱纯，上海国药集团)，甲醇(CMW公司)，三氟乙酸、甲醇钠和Zn(AC)a-2H,O均为国产分析纯，GGT
为实验室自制，纯度大于95% 2.2主要实验仪器
DIONEXUltimate3000高效液相色谱仪(HPLC，美国戴安公司），MicroMassQ-TOF电喷雾质谱仪(ESI-MS，英国Micro公司)，Nicolet360红外光谱仪(FT-IR，美国尼高力公司)，VarioELIⅡⅢI元素分析仪(德国Elementar公司)，SP-20E薄层色谱分析仪(汕头市科
毅仪器设备有限公司) 2.3实验方法
2.3.1茶氨酸的检测方法
以高效液相色谱分析产物浓度色谱条件为：色谱柱HypersilODS25μmCis(4.6mm×250mm)，流动相为1.0%三氟乙酸水溶液：甲醇=93:7()；检测波长200 nm，柱温25℃，流速1.0mL/min，茶氨酸保留时间4.5 min.以茶氨酸标准品建立标准山线：J=20.701x+0.9329(R=0.9996)，反应液中茶氨酸浓度以标准曲线定量.以 Zn(Gln)为反应物时，反应液需加入10%(g)1.0mol/L 稀盐酸处理后以HPLC定量，
收覆日期：2011-1222，修回日期；201204-10
基金项目：江苏省高校自然科学研究重大基金资助项目(编号：10KJA530014)：江苏省科技支撑计划(社会发展)基金资助项目(编号：SBE201078182)：江
苏省自然科学基金资助项H(编号：(BK2011799)
作奢简介：期国梅(1987-)，女，江苏省离通产人，硕十研究生，研究方向：生物化工：姚息，通汛联系人，Tel.：13605145491，E-mail:yaozhongnjutedu.cn
方方数据