SN ICS 67.050 CCS C53
中华人民共和国出入境检验疫行业标准
SN/T 5439.7—2022
出口食品中食源性致病菌快速检测方法PCR-试纸条法 第7部分：单核细胞增生李斯特氏菌
Rapid detection of foodborne pathogens from exported food by PCR-Lateral flow dipstick method—Part 7:Listeria monocytogenes
2022-03-14发布
2022-10-01实施
中华人民共和国海关总署
发 布
SN/T 5439.7-2022
出口食品中食源性致病菌快速检测方法PCR-试纸条法 第7部分：单核细胞增生李斯特氏菌
1 范围
本文件规定了出口食品中食源性致病菌-单核细胞增生李斯特氏菌快速检测的PCR-试纸条方法。本文件适用于出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定性检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 4789.30——2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 27403——2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
单核细胞增生李斯特氏菌Listeriamonocytogenes
其为革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5μm×1.0μm～2.0μm，直或稍弯，两端钝圆，常呈V字型排列，偶有球状、双球状，兼性厌氧、无芽胞。其是一类重要的食源性致病菌，可引起人类脑膜炎、败血症及孕妇流产等严重疾病，尤其是老人、新生儿及孕妇等免疫力低下者对单核细胞增生李斯特菌更易感。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid）
dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleoside triphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylene diaminetetraacetic acid）FITC：异硫氰酸盐（fluorescein 5-isothiocyanate）
Tris：三羟甲基氨基甲烷【tris（hydroxymethyl）aminomethane】
5 方法原理
对样品中单核细胞增生李斯特氏菌进行增菌培养后提取DNA，采用上游和下游引物分别经地高辛和异硫氰酸盐标记的单核细胞增生李斯特氏菌的特异性检测引物进行PCR扩增。检测用试纸条上含有金标记的抗异硫氰酸盐的抗体，可与PCR产物上的异硫氰酸盐标记分子结合，在检测线位置上有抗地高辛抗体，可与PCR产物上的地高辛标记分子结合，从而显色。如模板未扩增，则无PCR产物与地高辛抗体及 FITC抗体结合，从而不能在检测线（T线）位置显示颜色。
6 试剂和材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T 6682的要求。6.1 引物
单核细胞增生李斯特氏菌扩增引物详见表1，靶基因序列参见附录A。
表1 试验用引物片段长度
5’端标记物
靶基因
引物序列（5'→3'）致病菌种类地高辛
|F:5'-AACCTATCCAGGTGCTC-3'
单核细胞增生520 bp hlyA
李斯特氏菌
异硫氰酸盐
R:5'-CGCCACACTTGAGATAT-3'
6.2 试剂
6.2.1 DNA提取液：20 mmoL/LTris-HCl，2mmol/LEDTA，1.2%TritonX-100（pH8.0）。6.2.2 2× PCR预混液。6.2.3 PCR引物。
6.2.4 试纸条：通过采购的原料试剂自行组装（参见附录B），或采用等效的商品化试纸条。
6.2.5 展开液：10 mmol/L Tris、1% BSA、1%（体积分数）Tween20以及浓度为0.05 mol/L的NaOH；或采用等效的商品化产品。7 仪器设备
7.1 离心机：离心力≥12000g。
7.2 微量移液器：100μL～1000μL，20μL～200μL，0.5μL～10μL。7.3 PCR仪。
7.4 恒温水浴锅：100℃±1℃。7.5 天平：感量0.01 g。7.6 pH计。
7.7 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。
8 检验步骤8.1 样品制备和增菌
按照GB 4789.30—2016的方法进行样品制备和增菌。