SN ICS 67.050 CCS C 53
中华人民共和国出入境检验疫行业标准
SN/T 5439.1—2022
出口食品中食源性致病菌快速检测方法PCR-试纸条法 第1部分：沙门氏菌Rapid detection of foodborne pathogensfrom exported food by PCR-Lateral flow dipstick method—Part 1:Salmonella
2022-03-14发布
2022-10-01实施
发 布
中华人民共和国海关总署
SN/T 5439.1-2022
出口食品中食源性致病菌快速检测方法PCR-试纸条法 第1部分：沙门氏菌
1 范围
本文件规定了出口食品中食源性致病菌-沙门氏菌快速检测的PCR-试纸条方法。本文件适用于出口食品中沙门氏菌的定性检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 4789.4——2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T27403——2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。沙门氏菌 Salmonella
其为革兰氏阴性短杆菌，好氧或兼性厌氧，无荚膜，周身鞭毛能运动，偶然有无鞭毛的变种，属于肠杆菌科，是一种常见的病原菌。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid）
dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleoside triphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylene diaminetetraacetic acid）FITC：异硫氰酸盐（fluorescein 5-isothiocyanate）
Tris：三羟甲基氨基甲烷【tris（hydroxymethyl）aminomethane】
5 方法原理
对样品中沙门氏菌进行增菌培养后提取DNA，采用上游和下游引物分别经地高辛和异硫氰酸盐标记的沙门氏菌的特异性检测引物进行PCR扩增。检测用试纸条上含有金标记的抗异硫氰酸盐的抗体，可与PCR产物上的异硫氰酸盐标记分子结合，在检测线位置上有抗地高辛抗体，可与PCR产物上的地高辛标记分子结合，从而显色。如模板未扩增，则无PCR产物与地高辛抗体及FITC抗体结合，从而不能在检测线（T线）位置显示颜色。SN/T 5439.1—2022
6 试剂和材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T 6682的要求。6.1 引物
沙门氏菌扩增引物详见表1，靶基因序列参见附录A。
表1 试验用引物片段长度靶基因5’端标记物致病菌种类
引物序列（5'→3'）
地高辛
|F:5'-TCGCACCGTCAAAGGAACCGTAAGC-3'
inaA
310 bp
沙门氏菌
异硫氰酸盐
|R:5'-GCATTATCGATCAGTACCAGCCGTCT-3'
6.2 试剂
6.2.1 DNA提取液：20mmoL/LTris-HCl，2mmol/LEDTA，1.2% Triton X-100（pH8.0）。6.2.2 2×PCR预混液。6.2.3 PCR引物。
6.2.4 试纸条：通过采购的原料试剂自行组装（参见附录B），或采用等效的商品化试纸条。6.2.5 展开液：10 mmol/L Tris、1% BSA、1%（体积分数）Tween20以及浓度为0.05 mol/L的NaOH；或采用等效的商品化产品。7 仪器设备
7.1 离心机：离心力≥12000g。
7.2 微量移液器：100μL～1000μL，20μL～200μL，0.5μL～10μL。7.3 PCR仪。
7.4 恒温水浴锅：100℃±1℃。7.5 天平：感量0.01g。7.6 pH计。
7.7 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。
8 检验步骤8.1 样品制备和增菌
按照GB4789.4—2016的方法进行样品制备和增菌。8.2 样品DNA提取8.2.1 增菌液模板DNA的制备
对于8.1获得的增菌液，采用如下方法制备模板DNA：
a） 吸取1mL菌液加入1.5mL离心管中，12000g离心3min，弃上清；b）加入1mL0.85%无菌生理盐水，完全溶解沉淀，12000 g离心3min，弃上清；