NY/T 3446-2019
奶牛短脊椎畸形综合征检测PCR法
Detection of brachyspina syndrome in dairy cattle—PCR method
2019-11-01实施
2019-08-01发布
1 范围
本标准规定了奶牛短脊推畸形综合征的 PCR检测方法。
本标准适用于奶牛短脊椎畸形综合征基因型的分子检测与诊断。
2 规范性引用文件
6.2 10×PCR缓冲液（含Mg²*】
6.3 dNTIs（dATP、dCTP、dGIP、dTTP4种溶液的等比例混合液）6.4 DNA分子量标记
6.5 核酸染料
6.6 球脂糖6.7 75%乙醇6.8 50×TAE 缓冲液
取Tris碱242g，冰乙酸57.1 mL.0.5mol/L EDTA（pH8.0）100 mL，加水定容至1 000 mL，室温保存。
7 仪器设备7.1 PCR扩增仪
7.2 凝胶成像分析系统
7.3 电泳仪
7.4 水平电泳槽
7.5 可调移液器
7.6 离心机
7.7 干式加热器（或水浴锅）
7.8 电子天平
8 样品
8.1 样品准备
收集牛血液（新鲜或抗凝血》、组织（耳组织、肌肉、尾组织、皮肤等）、带毛囊的牛毛、精液等试验材料。血液、精液、组织样品一20℃及以下低温保存备用;带毛囊的毛发浸入75%乙醇中一20℃及以下低温保存备用。8.2 DNA 提取
按 GB/T 27642规定的方法执行。
9 试验步骤
9.1 PCR扩增
9.1.1 PCR 反应体系
10×PCR缓冲液（含Mg）2.5μL，dNTPs（（2.5mmol/L）4.0μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5μL，DNA模板50 ng～100 ng，长片段 Tag DNA聚合碍1.5 U，加水至 25 μL。
9.1.2 PCR 反应程序
94℃预变性5 minn94℃变性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸2.5 min，35个循环;72℃聚合延停10 min，4℃保存。
9.2 电泳检测