NY/T 3421-2019
家蚕核型多角体病毒检测荧光定量PCR法
Detection of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus—Real time PCR method
2019-09-01实施
2019-01-17发布
前 言
本标准按照GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。
本标准由农业农村部种植业管理司提出。
本标准由全国桑蚕业标准化技术委员会（SAC/TC 437）归口。
6.470%乙醇。
6.5 异丙醇。
6.6 PBS（组分∶NaCl 136.89 mmol/L;KCl 2.67 mmol/L;NaHPO， 8.1 mmol/L;KH，PO。1.76 mmol/L;pH=7.2~7.4)。
6.7 苯基硫脲。
6.8 RNase 酶。
6.9 荧光定量 PCR 试剂盒。
6.10 灭菌的枪头和离心管。
注∶除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T 6682一级水的规定。
7 主要仪器设备
7.1 实时荧光定量PCR仪。
7.2 紫外分光光度计。
7.3 高速冷冻离心机。
7.4 —20℃冰箱和-80℃冰箱。
7.5 组织研磨器或研钵。
7.6 微量加样器。
8 样品
8. 1 样品采集
8.1.1 血液∶用灭菌针刺破家蚕幼虫腹足或尾足，在冰上将血液采集于加了少量苯基硫脲的试管中，12000 g，4℃离心30 min，吸取上清液，—20℃冰箱保存备用。
8.1.2 组织∶采集家蚕组织（50 mg~100 mg）后迅速放入液氮中，再转移至一80℃冰箱保存备用。
8.2 样品 DNA提取
8.2.1 将组织样品放入预冷的研钵中加入液氮，用研杵将待检样品磨成粉末状，研磨过程中保持液氮不挥发干净。亦可用组织匀浆器按操作说明书处理样品。
8.2.2 在血液或按步骤
8.2.1制备的样品中加入400 μL 灭菌的 PBS、4 μL10 mg/mL RNase 酶、40μL20% SDS和8μL 20 mg/mL蛋白酶K，混合均匀，并将样品置于55℃～60℃水浴10 min～15 min，或者放置室温直至溶液澄清。
8.2.3 在8.2.2溶液中加入300μL6mol/L NaCl溶液，反复颠倒，轻柔混匀。12000 g，4℃离心10 min，收集上清液。
8.2.4 将上清液转移至新的已灭菌的离心管中，加入等体积的异丙醇或者2倍体积的无水乙醇，混合均匀后放置一20℃冰箱 30 min，12000g，4℃离心10 min，弃上清液，保留 DNA沉淀。
8.2.5 加入500 μL.70%预冷乙醇洗涤沉淀，12 000g，4℃离心5min，去乙醇。
8.2.6 将DNA沉淀置于室温下自然风干5 min～10 min，用30μL～40μL的无菌超纯水常温溶解DNA。
8.2.7 利用紫外分光光度计测定 DNA溶液的光密度值。当Aao/Azao值为1.75～1.85时，提取的DNA质量符合PCR的检测要求。调整 DNA浓度至50 ng/μL并置于一20℃冰箱保存备用。
注∶以上提供的DNA 提取方法并非唯一方法。其他提取方法或市售商品化 DNA提取试剂盒也可使用。
8.3 实时荧光定量 PCR检测
8.3.1 引物序列