ICS 11.100 C 04
GB
中华人民共和国国家标准
GB/T37966—2019
纳米技术 氧化铁纳米颗粒类过氧化物
酶活性测量方法
Nanotechnologies-Measurement method for peroxidase-like activity of
iron oxide nanoparticles
2019-08-30实施
2019-08-30发布
国家市场监督管理总局 发布
中国国家标准化管理委员会 GB/T37966—2019
目 次
前言引言 1 范围 2 规范性引用文件 3 术语和定义、缩略语
原理 5 仪器与试剂
溶液配制 7 测量步骤 8 测量结果处理 9 报告附录A（资料性附录）仪器准备附录B（资料性附录） 氧化铁纳米颗粒铁元素质量浓度测量附录C（资料性附录） 氧化铁纳米颗粒类过氧化物酶活性计算及不确定度评定实例参考文献
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15 GB/T37966—2019
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中国科学院提出。 本标准由全国纳米技术标准化技术委员会（SAC/TC279)归口。 本标准起草单位：东南大学、中国科学院生物物理研究所、南京东纳生物科技有限公司、中国医学科
学院基础医学研究所、江苏省计量科学研究院、基蛋生物科技股份有限公司、南京医科大学第二附属医院检验医学中心。
本标准主要起草人：张宇、顾宁、阎锡蕴、许海燕、黄一鑫、董海姣、温涛、吉永新、董金来、孙颖、顾加雨、 王路海、朱叶飞。
1 GB/T37966—2019
引言
氧化铁纳米颗粒由于丰富的磁学特性和良好的生物相容性而在生物医学等领域具有广泛的应用
包括磁分离与生物传感、磁共振成像、磁感应热疗、磁性纳米药物等，同时还被发现具有类过氧化物酶活性和类过氧化氢酶活性，这不仅拓展了磁性纳米材料的应用，也使模拟酶的研究从有机复合物拓展到无机纳米材料。目前，大量的基础研究和应用研究被报道，40多种纳米颗粒，包括四氧化三铁（Fe：O，）、 -三氧化二铁（-Fe2O：）、四氧化三钴（Co:O）、氧化铜（Cu2O）、锰铁氧体（MnFe2O。）、硫化铁（FeS）、氧化铈（CeO2）、普鲁士蓝（PB）、金（Au）、铂（Pt）、石墨烯、富勒烯、碳纳米管等，被发现具有类过氧化物酶活性和其他模拟酶活性，其中尤以Fe、Co、Cu、Mn等具有变价的Fenton元素化合物纳米颗粒最为典型，并且在生物、医学、环境、农业等多个领域获得应用。纳米颗粒模拟酶相对于天然酶具有简单易得、 稳定、成本低的优势，同时具有依赖于尺寸和表面可调的类酶活性，还兼具磁性、光学等其他多功能特性，因此更具研究意义和广泛的应用价值。
纳米颗粒类过氧化物酶活性是指单位质量或体积样本中酶活性单位数。由于纳米颗粒类酶活性显著地依赖其种类、尺寸、表面、晶体结构等多种因素，因此其催化活性的测量和评价比较复杂。这导致目前研究报道的纳米颗粒类酶活性数据难于比较，即使相同种类的纳米颗粒，其尺寸、表面等理化性质差异以及不同的测试条件都可能导致数据不具可比性。因此，建立一种纳米颗粒类酶活性测量和评价的标准方法至关重要
.
本标准为发展相关检测和医学诊疗试剂，以及环境、农业等领域中纳米材料类酶活性的评价提供了参考。
II GB/T37966—2019
纳米技术 氧化铁纳米颗粒类过氧化物
酶活性测量方法
1范围
本标准规定了氧化铁纳米颗粒类过氧化物酶活性的测量方法，本标准适用于采用分光光度计对氧化铁（如三氧化二铁、四氧化三铁等）纳米颗粒类过氧化物酶活
性进行测量和评价。其他纳米颗粒的类过氧化物酶活性测量亦可参考。
规范性引用文件
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SZIC 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T19267.2刑事技术微量物证的理化检测第2部分：紫外-可见吸收光谱法 JJG178紫外、可见、近红外分光光度计检定规程
3 ：术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1
纳米颗粒 nanoparticles 三个维度的外部尺寸都在纳米尺度的纳米物体 [GB/T32269—2015,定义4.1]
3.1.2
酶活性 enzymeactivity 酶催化某一化学反应的能力注1：酶活性大小可以用在一定条件下酶催化的某一化学反应的反应速率来表示注2：在本标准中氧化铁纳米颗粒类过氧化物酶活性是指单位Fe元素质量对应的氧化铁纳米颗粒所含酶活性单位
数，单位为U·mg-1。
注3：酶活性单位：国际生物化学协会酶学委员会推荐使用国际单位，即在规定条件下，每分钟催化一微摩尔（umol）
底物的酶量为一个国际单位（IU），简称U。1U=1μmol·min-1。
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。 DMSO：二甲基亚（Dimethyl sulfoxide) H,Oz：过氧化氢（Hydrogenperoxide） NPs：纳米颗粒（Nanoparticles） SOP：标准操作方法（StandardOperationProcedure） TMB：3，3°，5，5'-四甲基联苯胺（33°，5，5'-Tetramethylbenzidine)
1 GB/T37966—2019
4原理
如图1所示，采用3，3"，5，5-四甲基联苯胺（TMB)作为测量底物，在37℃和酸性条件（pH=3.6) 下经氧化铁纳米颗粒的催化，TMB被H，O，氧化为蓝色的TMB衍生物，该衍生物在650nm波长下有特征吸收峰。在37℃、650nm波长下检测反应溶液吸光度随时间的变化，并根据朗伯比尔定律计算出单位时间内TMB衍生物的生成量，从而得到氧化铁纳米颗粒所含酶活性单位数（bara）。将bman除以加人的氧化铁纳米颗粒的铁元素质量，得到单位铁元素质量的氧化铁纳米颗粒所含酶活性单位数（αna），即氧化铁纳米颗粒类过氧化物酶活性。
A
氧化铁纳米颗粒 37 ℃, pH=3.6
入mux=650 mm
M/r
921
时间/s
TMB+H202
TMBax+H20
图1测量原理图
5仪器与试剂
5.1仪器与器具 5.1.1概述
仪器与器皿包括分光光度计、温度计、pH计、恒温水浴箱、天平、可调移液器、容量瓶、比色皿、计时器等。仪器准备参见附录A。 5.1.2分光光度计
仪器测试波长范围应包括650nm，具有“动力学模式”。吸光度准确度士0.005，波长准确度（650士 1)nm，光谱带宽≤2nm。仪器校正及实验条件的设定应符合GB/T19267.2的规定。 5.1.3温度计
用来测量样品溶液温度，误差士1.5%，灵敏度士0.1℃。
5.1.4pH计
用来测量样品溶液pH，准确度等级为0.01级，灵敏度土0.01。 5.1.5恒温水浴箱
与分光光度计连接，控制比色皿槽恒温为（37土1)℃。 5.1.6天平
用来称量试剂质量，最小分度值0.01mg，重复性（校验码）≤0.015mg（5g）。
2 GB/T37966—2019
5.1.7 可调移液器
200μL、1000μL可调移液器。 5.1.8 容量瓶
10mL、100mL容量瓶。 5.1.9比色皿
光程为（10.00±0.05)mm。 5.2 2试剂
所用试剂见表1。
表1试剂化学名称
分类
别名/缩略语醋酸钠冰醋酸
无水乙酸钠（分析纯）无水乙酸（分析纯）
试剂
TMB 双氧水无 DMSO 无无无
3,3°，5,5'-四甲基联苯胺（分析纯）
30% H202 高纯度水
电导率<2μS·cm-1,pH6~7
溶剂
二甲基亚砜
铁单元素标准溶液（GBW08616) 邻苯二甲酸氢钾（GBW(E)130070）混合磷酸盐（GBW（E)130071)
标准物质
6 溶液配制
6.1 一般要求
配制溶液时各成分给出的质量是指100%含量。如果化学物质的含量低于100%「例如v（%）7，则应用因子：Fcontent=100/y，计算出与给出质量相当的某化学物质的质量。
溶液的配制要求应符合GB/T19267.2的规定。 使用天平称量时，称量差异不应超过士0.5%。 摩尔吸光系数具有显著的PH依赖性。因此，应严格校准PH计和调整缓冲液的PH值。使用至
少两种标准缓冲液进行校准，校准缓冲液的定值包括的范围应包含或接近本标准中反应的pH值。 6.2溶液1
称量醋酸钠0.164g，溶解于8mL水，转移至10mL容量瓶中，加水至容量瓶刻度得0.2mol·L-1 的醋酸钠溶液。
取冰醋酸1.144mL，溶解于80mL水，转移至100mL容量瓶中，加水至容量瓶刻度得0.2mol·L-
3 GB/T37966—2019
的冰醋酸溶液。
将适量两种溶液混匀测pH,并用少量0.2mol·L-1的冰醋酸溶液或0.2mol·L-1的醋酸钠溶液调节pH至3.6（37℃），得0.2mol·L-1，pH=3.6的冰醋酸/醋酸钠缓冲液。该溶液2℃～8℃保质期为3个月。 6.3 溶液2
称量TMB0.10g溶于8mLDMSO中制成稳定的分散液，转移至10mL容量瓶中，加DMSO至容量瓶刻度得10g·L-1TMB的DMSO溶液。该溶液2℃～8℃避光保存，保质期为1个月，宜分装保存。使用时应使其充分溶解，避免反复冻融，观察是否变色，并采用紫外可见分光光度计检验其吸收光谱是否发生变化。如果发生变化则严禁使用，并重新配制。 6.4纳米颗粒分散液
将待测的氧化铁纳米颗粒分散液用水稀释至适宜浓度。
7 测量步骤
7.1 测量条件
具体测量条件见表2。
表2测量条件
参数温度检测波长光程孵育时间测量时间读点数
指标 (37±1)℃ (650±1)nm (10.00±0.05)mm
(60±10)s ≥300 s ≥11
7.2 测量步骤 7.2.1 启动分光光度计，放入装有纯水的比色血，进行基线校准和调零 7.2.2 开启恒温水浴箱，监测比色皿内温度，达到37℃时开始准备试剂与待测液。 7.2.3 将适当体积的溶液1、氧化铁纳米颗粒分散液、溶液2和30%H.O2在恒温水浴中平衡到37℃。 7.2.4 将上述溶液按表3的体积和顺序加入到反应杯中。
表3测量步骤
体积 2.00 mL
步骤
溶液1 加人到反应杯中，并且平衡至37℃ 氧化铁纳米颗粒分散液加入到反应杯中，充分混合
0.100 mL
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