ICS 07.120 CCSC04
GB
中华人民共和国国家标准
GB/T41212—2021/ISO/TS19006:2016
纳米技术 荧光素二乙酸酯法检测纳米颗粒诱导巨噬细胞产生的活性氧
Nanotechnologies--5-(and 6)-Chloromethyl-2',7' Dichloro-dihydrofluorescein diacetate (CM-HDCF-DA) assay for evaluating nanoparticle-induced intracellular reactive oxygen species (ROS) production in RAW 264.7 macrophage cell line
(IS0/TS 19006:2016,IDT)
2022-07-01实施
2021-12-31发布
国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会
发布 GB/T41212—2021/ISO/TS19006:2016
目 次
前言引言
范围规范性引用文件
1
2
3 术语和定义 4 符号和缩略语 5 材料 6 技术设备
纳米颗粒样品制备准备工作 8.1 概述 8.2 流式细胞仪校准 8.3 实验培养基 8.4 试剂制备 8.5 细胞培养物的准备 8.6 准备实验用的培养物 8.7 检测细胞生长状态 8.8 评估纳米颗粒的干扰 8.9 对照组的准备 8.9.1 概述 8.9.2 对照组说明 8.9.3 Sin-1储备溶液制备(1mM) 9 评价纳米材料对细胞内ROS产生的影响 9.1 准备24孔板中的细胞 9.2 用对照物和不同浓度纳米颗粒处理细胞 9.3 CM-H,DCF-DA细胞暴露 9.4 用CM-H,DCF-DA孵育细胞 9.5 流式细胞仪分析 10数据分析和结果附录A（资料性） 替代细胞系附录B（资料性) 可替代的荧光表征技术附录C（资料性） 悬浮液的制备和表征附录D（资料性） 来自RAW264.7的实验数据示例参考文献
7
8
12
.4
16 GB/T41212—2021/IS0/TS19006:2016
前 言
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件使用翻译法等同采用ISO/TS19006：2016《纳米技术荧光素二乙酸酯法检测纳米颗粒诱导巨噬细胞产生的活性氧》。
与本文件中规范性引用的国际文件有一致性对应关系的我国文件如下：
GB/T16886.5一2017医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验（ISO10993-5： 2009,IDT)。
本文件做了下列编辑性修改：
将术语和定义一章引导语引用的文件列人了第2章“规范性引用文件”；参考文献重新排序。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任本文件由中国科学院提出。 本文件由全国纳米技术标准化技术委员会（SAC/TC279)归口。 本文件起草单位：国家纳米科学中心、中国医学科学院基础医学研究所、中国食品药品检定研究院。 本文件主要起草人：吴晓春、纪英露、樊慧真、李海芸、李一叶、聂广军、许海燕、温涛、文海若、淡墨。 GB/T41212—2021/ISO/TS19006:2016
引言
随着新材料、产品和应用的不断开发，纳米技术领域持续快速发展。与此同时，人们对其中一些纳米材料对人类健康和环境可能造成潜在风险的疑虑也在不断上升。目前国际上正在开展大量的相关研究，以便更好地了解和量化这些潜在风险。此外，在加工过程中或最终产品中用于包覆纳米颗粒表面的化学品也可能影响纳米颗粒与细胞之间的相互作用。特别是考虑到纳米颗粒比表面积大的特点，这一影响可能会更加突出。因此，对这些化学功能化的纳米颗粒，需要发展可靠、快速的筛选方法来判定其潜在的颗粒毒性。
监测纳米颗粒暴露后模式细胞的生物响应有望加深我们对纳米颗粒“作用模式”的理解，以及判断其中哪些因素可能需要进一步研究以便进行接下来的风险评估。
2008年，国际上一些研究团队发现，一些已发表的纳米材料毒性研究结果在不同的实验室无法重复，需要发展准确并可以重复的纳米毒理学测试方法。纳米环境健康与安全（nanoEHS)协调国际联盟（IANH)应运而生，旨在开发可以准确评估纳米颗粒毒性及其与细胞生物作用的测试规程，并且这些测试规程在任何实验室均可重复。IANH采用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑(MTS)法、5-(6)-氯甲基-2'，7'-二氯-二氢荧光素二乙酸酯(CM-H2DCF-DA)法和碘化丙啶法，对液体悬浮液中的粒径分布和纳米材料与细胞的体外相互作用进行了比对研究。IANH发现了一些增加测试不确定性的因素，并开发了降低此类不确定性的技术。
氧化应激可导致DNA损伤，是造成生物体突变累积的主要驱动力。因此评估纳米颗粒是否会导致活细胞产生活性氧(ROS)非常重要
本文件提供了评估纳米颗粒细胞暴露产生ROS的体外测量方法。虽然测定细胞内ROS产生有很多技术，但目前仅开展了CM-H,DCF-DA法评价RAW264.7小鼠巨噬细胞ROS产生的比对研究。 CM-H2DCF-DA法是检测细胞氧化应激的一种常用方法，对氧自由基或氧活性物种不具有特异性[9]。 虽然该方法尚未在更为广泛的细胞系中进行评估，但它提供了深人了解巨噬细胞中ROS产生可能性，而这一机制可能在清除体内颗粒中发挥重要作用。
在有对照组的情况下，CM-H2DCF-DA法也可能出现误判。有若干因素可能会造成假阴性[9]。 CM-H,DCF-DA法并非对所有的ROS都能实现最佳检测。例如，对半衰期较短的超氧阴离子和羟基自由基，其检测效果欠佳。2",7'-二氯二氢荧光素(DCFH)和2'，7'-二氯荧光素（DCF)能从细胞中浸出或DCFH被氧化，因此用流式细胞仪测量时，应在细胞暴露后迅速进行检测。此外，CM-H2DCF-DA法在血清中失效，在清洗细胞去除血清的过程可能会造成细胞丢失，产生假阴性。一些纳米颗粒可能与 DCFH相互作用导致荧光部分灭。因此，如果存在上述情况，实验测得的ROS阴性结果并不是绝对的。ISO/TS18827用电子自旋共振(ESR)波谱法检测细胞中ROS。该方法可以在无干扰的情况下区分不同的ROS。
反过来，有些因素可能会造成假阳性10]。有些纳米颗粒及死细胞会发荧光。有些纳米颗粒可催化 CM-H2DCF-DA氧化。检测试剂可能会优先吸附在颗粒表面[10]。为确保阳性结果可靠，应在测试条件下采用对照组单独对纳米颗粒进行表征，并将死细胞产生的荧光与活细胞ROS产生的荧光区分开。
此外，CM-H2DCF-DA可发生光诱导的自氧化，因此其储备液无论浓度高低都应在充氮/氩气的密闭容器中避光储存，防止光线照射和空气进入。
因此，CM-H,DCF-DA法可能仅适用于特定的细胞系和纳米颗粒。在给出最终结论前，还应借助其他检测方法对结果进行进一步确认（参见附件A替代细胞系）。当检测体系中存在着可能会造成假阴性或假阳性结果的因素时，尤其需要注意。例如，对于阳性结果，应寻找其他检测方法确保该阳性结
I GB/T 41212—2021/IS0/TS 19006:2016
果不是由干扰引起的。其他需要考虑的因素包括：应用对照组确定未暴露细胞的荧光基线；应确定细胞是否受无毒纳米颗粒的影响；应确保ROS阳性对照试剂和纳米颗粒产生的ROS在所使用的测定条件下都能被检测到。此外，还需确定纳米颗粒是否干扰荧光测定，进一步导致颗粒诱导细胞产生ROS的评估结果无效。如果可能存在这一于扰，可用暴露于3-吗啉代二亚胺（Sin-1）的细胞添加不同剂量的纳米颗粒进行对照实验，以判定纳米颗粒是否淬灭荧光。
注：此方法被认为是一种快速筛选纳米颗粒与细胞相互作用的方法。虽然筛选类方法在评估纳米颗粒的细胞效应
时非常关键，但结果解释能够被其他ROS及相关的细胞检测方法验证也是非常重要的。 GB/T41212—2021/ISO/TS19006:2016
纳米技术荧光素二乙酸酯法检测纳米颗粒诱导巨噬细胞产生的活性氧
1范围
本文件描述了如何用5-(6)-氯甲基-2'，7'二氯二氢-荧光素二乙酸酯（CM-H,DCF-DA)检测和评价 RAW264.7巨噬细胞暴露于纳米物体、纳米颗粒及其聚集体和团聚体后产生活性氧(ROS)的方法。
本文件适用于用24孔板的检测。如果用其他孔板，需要调整样品用量并检验操作步骤的有效性以保证检测结果可信。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
ISO10993-5医疗器械生物学评价 个第5部分：体外细胞毒性试验（Biologicalevaluationof medical devices—Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity)
ISO/TS80004-2纳米技术术语第2部分：纳米物体（Nanotechnologies—Vocabulary—Part2： Nano-objects)
3术语和定义
ISO/TS80004-2、ISO10993-5界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 下列网址为ISO和IEC负责的应用于标准中的数据库网址。 ISO在线浏览平台：http：//www.iso.org/obp IEC在线浏览平台：http：//www.electropediaorg/
3.1
团聚体agglomerate 弱束缚颗粒的堆积体、聚集体或二者的混合体，其外表面积与其单个颗粒的表面积的总和相近。 注1：支撑团聚体的作用力都是弱力，如范德华力或简单的物理缠结。 注2：团聚体也被称为次级颗粒，而源颗粒则被称为初级颗粒。 [来源：ISO/TS80004-2：2015,3.4]
3.2
聚集体aggregate 强束缚或融合在一起的颗粒构成的新颗粒，其外表面积可能显著小于其单个颗粒表面积的总和。 注1：支撑聚集体的力都是强作用力，如共价键或源于烧结或复杂的物理缠结。 注2：聚集体也被称为次级颗粒，而源颗粒则被称为初级颗粒。 ［来源：ISO/TS80004-2:2015,3.5]］
3.3
培养器血皿culturevessels 包括玻璃培养血、塑料培养瓶或塑料多孔培养板和微量滴定板等适用于细胞培养的器血。
1 GB/T41212—2021/ISO/TS19006:2016
注：在这些试验方法中，这些器皿只要符合组织培养级别的要求，并适用于哺乳动物细胞培养，可以互换使用。 ［来源：GB/T16886.5—2017,3.1,有修改］
3.4
分散体系dispersion 微观多相系统，其中非连续态（固体，液体或气体：不连续相)分散在组成或状态不同的连续相中。 注：如果是固体颗粒分散在液体中，则将该分散体系称为悬浮液。如果分散体系由两个或多个液相组成，称为乳
液。悬浮乳液由分散在连续液相中的固相和液相组成。 ［来源：ISO/TR13097:2013,2.5]
3.5
内毒素endotoxin 革兰氏阴性菌细胞膜外膜的一部分。 注：主要活性成分为脂多糖(LPS)。 ［来源：ISO29701:2010,2.3］
3.6
纳米物体nano-object 一维、二维或三维外部尺寸处于纳米尺度（3.8)的物体。 注：三个外部维度互相垂直。 ［来源：ISO/TS80004-2：2015,2.2]
3.7
纳米颗粒 nanoparticle 三个维度的外部尺寸都在纳米尺度的纳米物体（3.6）。 注：如果纳米物体最长轴和最短轴的长度差别显著(大于3)时，可用纳米棒和纳米片来表示纳米颗粒。 [来源：ISO/TS80004-2:2015，4.4]
3.8
纳米尺度 nanoscale 处于1nm至100nm之间的尺寸范围。 注：本尺寸范围通常、但非专有地表现出不能由较大尺寸外推得到的特性。 [来源：ISO/TS80004-2：2015,2.1，有修改］
3.9
阴性对照材料 negativecontrol material 不产生细胞毒性反应的材料或化学品。 注1：阴性对照的目的是显示细胞的背景反应。 注2：材料或化学品根据GB/T16886.5—2017进行测试。 [来源：GB/T16886.5—2017,3.4，有修改］
3.10
颗粒particle 具有确定物理边界的一小部分物质。 注1：一个边界也可以看成一个界面。 注2：一个颗粒可以作为一个整体移动。 注3：该通用颗粒定义适用于纳米物体（3.6)。 ［来源：ISO/TS80004-2:2015,3.1]
3.11
阳性对照材料 positive control material 可再现细胞毒性反应的材料或化学品。
2 GB/T41212—2021/ISO/TS19006:2016
注1：阳性对照的目的是显示适用试验系统的反应，例如用有机锡作稳定剂的聚氨酯已用作固体材料和浸提液的阳
性对照，苯酚的稀释液用于浸提液的阳性对照。除了一种材料外还可采用纯化学品来证明试验系统的性能。
注2：材料或化学品根据ISO10993-5进行测试。 ［来源：GB/T16886.5—2017，3.2，有修改］
3.12
沉降 sedimentation 分散相因其中分散颗粒的密度高于连续相发生的下沉（分离）。 注：分散相聚集在容器底部表明沉降已发生。 ［来源：ISO/TR13097：2013，2.13，有修改］
3.13
试验样品 testsample 用于生物学试验、化学试验或评价的材料、器械、器械的一部分、组件、浸提液或其中一部分。 ［来源：GB/T16886.5—2017,3.5］
4: 符号和缩略语
下列符号和缩略语适用于本文件。 CM-H2DCF-DA：5-（6)-氯甲基-2'，7'二氯二氢-荧光素二乙酸酯[5-（and-6)-chloromethyl-2',7'Di
chloro-dihydro-fluorescein diacetate,acetyl esterj
DCF：2',7'-二氯荧光素（2',7'-dichlorofluorescein) DMEMDulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco'smodifiedEaglemedium) DMSO：二甲基亚砜（dimethylsulfoxide) FBS：胎牛血清（fetalbovineserum） MESF：可溶性荧光基团（molecularequivalentsofsolublefluorophore) MTS:3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑[3-(4,5-dimeth-
ylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazoliumJ
PBS：磷酸缓冲盐溶液（phosphatebufferedsaline） ROS：活性氧（reactiveoxygenspecies） Sin-1：3-吗琳代二亚胺（3-morpholinosydnonimine)
5材料 5.1细胞系
RAW264.7为小鼠单核巨噬细胞，由Abelson鼠科白血病病毒诱导生成，应经DNA鉴定验证其来源。
如果需要冻存细胞，则应在相应培养基中添加冷冻保护剂，如二甲基亚砜或甘油，存储温度应在一80℃或以下。长期冻存（几个月到几年）则需要在一130℃或以下。
不含支原体的细胞才能用于测试。在使用前，应测试冻存的细胞是否存在支原体。 由于检测灵敏度可能随传代次数发生变化，应定期检查细胞（如形态、倍增时间、模态染色体数）
状态。
用MTS法测定纳米颗粒的细胞毒性时，应遵循细胞培养技术的基本原则中关于冻存细胞扩增的操作。
注1：如果需要，见参考文献[7]中有关细胞复苏和培养的良好规范。 注2：见附录D，RAW264.7实验数据实例。
3