ICS 07.120 CCS C 04
G
中华人民共和国国家标准
GB/T41917—2022/ISO/TS18827:2017
纳米技术 电子自旋共振（ESR）
法检测金属氧化物纳米材料
产生的活性氧（ROS）
Nanotechnologies-Electron spin resonance (ESR) as a method for
measuringreactiveoxygenspecies(ROs)generatedbymetaloxidenanomaterials
(IS0/TS 18827:2017,IDT)
2023-05-01实施
2022-10-12发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会 发布 GB/T41917—2022/ISO/TS18827:2017
目 次
前言引言范围
I
元
1
2 规范性引用文件 3术语、定义和缩略语
3.1 术语和定义 3.2 缩略语 4 原理 4.1 概述
4.2 自旋捕获方法 4.2.1 概述 4.2.2 DMPO 4.2.3 BMPO 4.2.4 TPC 4.3自由基阳性对照 4.3.1 芬顿反应[17] 4.3.2次黄嘌岭/黄嘌岭氧化酶体系[18]。
孟加拉红光敏作用[19,20]
4.3.3 5 试剂
仪器样品制备 7.1 测试样品制备（金属氧化物纳米材料悬浮液) 7.2产生羟基自由基的溶液制备 7.2.1FeSO4溶液 7.2.2HOz溶液· 7.3产生超氧阴离子的溶液制备 7.3.1磷酸缓冲液 7.3.2次黄嘌岭溶液 7.3.3黄嘌岭氧化酶溶液 7.4产生单线态氧溶液的制备 7.5 自旋捕获剂的制备 7.5.1 概述 7.5.2DMPO储备液
6 7 GB/T41917—2022/ISO/TS18827:2017
5
7.5.3BMPO储备液 7.5.4TPC储备液 7.6测试样品和自旋捕获剂之间的反应 7.6.1 概述 7.6.2DMPO的反应 7.6.3BMPO的反应 7.6.4TPC的反应 7.7阳性对照和自旋捕获剂的反应 7.7.1DMPO自由基加合物的形成(DMPO/·OH) 7.7.2BMPO自由基加合物的形成(BMPO/·OOH) 7.7.3TPC自由基加合物的形成(TPC/1O2) 7.8用于自旋计算的标准物质的制备 8影响因素 8.1 采样 8.2采样时间 9操作步骤 9.1 概述 9.2 样品注人 9.3 ESR测试 10 测试结果举例 10.1 DMPO/.OH 10.2BMPO/.OOH 10.3 TPC/02 10.4 TEMPOL 参考文献
.
..
X
13 13
14 14
14
： GB/T41917—2022/IS0/TS18827:2017
前 言
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件等同采用ISO/TS18827：2017《纳米技术 电子自旋共振（ESR)法检测金属氧化物纳米材料产生的活性氧(ROS)》。文件类型由ISO的技术规范调整为我国的国家标准。
本文件做了下列最小限度的编辑性改动：
参考文献重新排序。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国科学院提出。 本文件由全国纳米技术标准化技术委员会（SAC/TC279)归口。 本文件起草单位：国家纳米科学中心、许昌学院。 本文件主要起草人：吴晓春、纪英露、樊慧真、何伟伟。
II GB/T41917—2022/ISO/TS18827:2017
引言
近年来，金属和金属氧化物纳米材料在生物医学和工业中的应用急剧增加。然而，大多数人造纳米材料的细胞毒性和遗传毒性的科学原理尚不完全清楚。活性氧（ROS)的产生是纳米毒性的一个重要机制。金属氧化物纳米材料的危害效应研究尚处于起步阶段。ROS的产生能力是金属氧化物纳米材料毒性的主要来源之一。过量的ROS可引起氧化应激，导致细胞不能维持正常的生理氧化还原调节功能，进而可能导致DNA损伤、细胞信号通路失调、细胞迁移变化、细胞毒性、细胞凋亡和肿瘤的发生。 ROS的产生取决于诸多关键因素，包括尺寸、形状、颗粒表面、表面正电荷、表面官能团、颗粒的溶解性、 纳米金属和纳米金属氧化物释放的金属离子、紫外光激活、团聚、与细胞的作用方式、炎症以及介质的 pH[4。因此，为了检测并定量金属氧化物纳米材料表面产生的ROS，本文件提出了电子自旋共振 (ESR)法。
在ROS中，最具生物学相关性且被广泛研究的有羟基自由基（·OH)、超氧阴离子（O2-）、单线态氧（1O2）和过氧化氢（H2O2）。
然而，在室温下直接检测溶液中的某些自由基（如超氧阴离子和羟基自由基)是非常困难或不可能的[5]。ESR自旋捕获技术是研究瞬态自由基的一种非常有用的工具6]。发展于20世纪60年代末的自旋捕获技术，是利用硝酮或硝基化合物（自旋捕获剂)与目标自由基反应，形成稳定的、可识别的自由基（自旋加合物），再使用ESR波谱仪检测的一种技术。
自旋加合物可被ESR波谱仪直接检测。自旋加合物的ESR波谱具有特异性，可以提供ROS存在的指纹特征。
本文件规定了利用ESR检测金属氧化物纳米材料产生的5，5-二甲基-1-吡略咯啉-N-氧化物(DMPO) 和羟基自由基的加合物、5-权丁氧羰基-5-甲基-1-吡咯琳-N-氧化物（BMPO)和超氧阴离子的加合物，以及2,2,5，5-四甲基-3-吡咯啉-3-氨甲酰胺(TPC)和单线态氧的加合物的方法。本文件提供了一种在非细胞环境下评估金属氧化物纳米材料产生ROS的方法。该方法可为处在理化性质评估阶段还未进行细胞毒性测试的纳米材料，提供有价值的ROS介导的细胞毒性预测信息。
IV GB/T41917—2022/IS0/TS18827:2017
纳米技术电子自旋共振（ESR）
法检测金属氧化物纳米材料
产生的活性氧(ROS)
1范围
本文件描述了一种利用电子自旋共振（ESR)检测金属氧化物纳米材料在水溶液中产生的活性氧 (ROS)（·OH、O，和"O,)的方法。
本文件不适用于未使用ROS特异性自旋捕获剂的ESR检测方法。
2规范性引用文件
本文件没有规范性引用文件。
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1
纳米材料 nanomaterial 任一外部维度、内部或表面结构处于纳米尺度的材料。 注1：本通用术语包括纳米物体和纳米结构材料。 注2：见ISO/TS80004-1；2015,2.8-2.10。 ［来源：ISO/TS80004-1:2015，2.4]
3.1.2
试验样品 test sample 用于生物学试验、化学试验或评价的材料、器械、器械的一部分、组件、浸提液或其中一部分。 ［来源：GB/T16886.5—2017,3.5J
3.1.3
零基线对照 zerobaselinecontrol 相当于未检测到自由基时的阳性对照。 注：例如，芬顿反应阳性对照的零基线对照为不含铁的HzO2和DMPO的混合溶液；次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶（HX-
XO)体系为不含HX-XO的次黄嘌呤和BMPO；盂加拉红光敏化体系为无光条件的盂加拉红和TPC。
3.1.4
阳性对照 positive control 经充分表征的材料和/或物质。该材料和/或物质当用于某一规定试验方法评价时，证实该试验程
序对于在试验系统中得出具有重复性的、适当阳性或反应性应答是适宜的。
［来源：GB/T16886.12—-2017,3.12] 3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
1 GB/T41917—2022/ISO/TS18827:2017
BMPO：5-叔丁氧羰基-5-甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline-N- oxide)
DMPO：5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物（5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide) DTPA：二亚乙基三胺五醋酸（diethylenetriaminepentaaceticacid) ESR：电子自旋共振(electronspinresonance) O,：超氧阴离子(superoxideanionradical) 102：单线态氧（singlet0xygen） OH-：氢氧根（hydroxideion） ·OH：羟基自由基（hydroxylradical) ROS：活性氧（reactiveoxygenspecies） TEMPOL：4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基（4-hydroxyl-2，2，6，6-tetramethylpiperidine-1
oxyl)
TPC：2,2,5,5-四甲基-3-吡咯啉-3-氨甲酰胺（2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-carboxamide）
4原理
4.1概述
大多数原子和分子中电子是配对的。配对电子不产生ESR信号，具有未成对电子的原子和分子才能产生ESR信号。当这些原子或分子处在磁场中时，未成对电子的自旋方向可以与磁场方向相同或相反，导致其具有不同的能量。因此外加磁场可解除未成对电子自旋态的简并。ESR波谱测量非简并自旋态间跃迁时微波辐射的吸收[7]。 4.2自旋捕获方法 4.2.1概述
自旋捕获在ESR波谱法中用于检测和识别短寿命的自由基。理想情况下，自旋捕获剂和自由基形成的加合物对该自由基具有特异的ESR波谱特征。ESR波谱法采用自旋捕获剂可识别不同类型的ROS。 4.2.2DMPO
DMPO与其他硝酮类自旋捕获剂相比具有明显的优势，特别适用于识别以氧为中心的自由基，如超氧阴离子和羟基自由基。DMPO和羟基自由基的ESR信号由强度比为1：2：2：1的四重峰组成，其超精细分裂常数an=a=1.49mT～1.5mT，与DMPO/·OH加合物一致[8]。 4.2.3BMPO
BMPO能形成ESR波谱可识别的加合物，适用于体内或体外短寿命超氧阴离子和羟基自由基的特异性检测[9]。其他硝酮类自旋捕获剂不易区分超氧自由基和羟基自由基，如DMPO-超氧加合物 (t1/2=0.9min～1.3min)可自发衰变为DMPO-羟基加合物。而BMPO-超氧加合物不会衰变为羟基加合物且半衰期更长（t1/2=8.5min～15.7min)[10)。BMPO-超氧加合物拟合得到超精细分裂常数an= 1.34mT和a=1.18mT(11,12)。 4.2.4TPC
对于单线态氧的检测，TPC具有适宜的灵敏度和动态范围[13]。TPC-单线态氧加合物ESR谱图显
2 GB/T41917—2022/ISO/TS18827:2017
示出强度比为1：1：1的三重峰[14],超精细分裂常数an=0.172mT[15]。
注1：磁核的超精细分裂常数(α为谱线的超精细分裂，a；中的i为核的类型，例如'H、"C、14N)和ESR谱线的模式
包含了这些自由基结构和几何结构的信息。 注2：谱线宽度是共振率-能量吸收状态的特征[16]。
4.3自由基阳性对照
芬顿反应、次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶(HX-XO)体系和孟加拉红光敏剂体系能分别产生羟基自由基、 超氧阴离子和单线态氧。这些体系证实了自旋捕获剂的适用性，自旋加合物可重复产生ESR信号特征，如强度比和超精细分裂。 4.3.1芬顿反应[17]
过渡金属离子可以激活H2O2，形成具有强氧化性的羟基自由基，称为“芬顿反应”。二价铁离子被双氧水氧化为三价铁离子，生成一个羟基自由基和一个氢氧根离子（反应1）。芬顿反应中产生的羟基自由基可以被DMPO捕获，形成自旋加合物DMPO/·OH(反应2)。
Fe2++H,O2→Fe++.OH+OH .OH+DMPO→DMPO/.OH
（反应1) （反应2)
4.3.2次黄嘌岭/黄嘌呤氧化酶体系[18]
次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶（HX-XO)体系能够产生超氧阴离子（反应3和反应4）。超氧阴离子可被 BMPO捕获形成自旋加合物BMPO/·OOH(反应5）。
黄嘌岭氧化酶、黄嘌呤+H202
次黄嘌岭+H20+十02
（反应3）（反应4) （反应5)
黄嘌岭+Hz0十Oz 黄嘌呤氧化酶 尿酸+0
O2-+BMPO→BMPO/.0OH
4.3.3．孟加拉红光敏作用[19,20]
孟加拉红是单线态氧的光敏剂。当光激发时，孟加拉红将其激发态能量转移至氧分子产生单线态氧（反应6和反应7）。单线态氧可被TPC捕获形成加合物TPC/1O2（反应8）。
光照（入mx约为550nm）
孟加拉红
孟加拉红’
（反应6) （反应7) （反应8)
孟加拉红’十02→孟加拉红+02
10z+TPC→TPC/102
5试剂
使用分析纯试剂、去离子水或等同纯度的水。 5.1 自旋捕获剂，如DMPO、BMPO和TPC。 5.2阳性对照试剂，如FeSO.、HzO2、磷酸缓冲液(pH7.4)、DTPA或螯合型离子交换树脂、次黄嘌呤、 黄嘌呤氧化酶、孟加拉红。 5.3去离子水（25℃C时18.2MQ）。 5.4自旋计算用标准物质，如TEMPOL。
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