ICS 13.300 A 80
C D
中华人民共和国国家标准
GB/T27858—2011
化学品 沉积物-水系统中摇蚊毒性试验
加标于水法
Chemicals-Sediment-water chironomid toxicity test-Spiked water method
2012-08-01实施
2011-12-30发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
中国国家标准化管理委员会 发布 GB/T27858—2011
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准与经济合作与发展组织（OECD)化学品测试导则219《化学品试验指南 沉积物-水系统中
摇蚊毒性试验加标于水法》(2004年4月）(英文版)技术性内容相同。
本标准做了下列结构和编辑性修改：
为与现有系列国家标准一致，将标准名称改为《化学品 沉积物-水系统中摇蚊毒性试验加标于水法》；一将OECD219中的“介绍”作为本标准的“引言”；将OECD219中的附件1“术语和定义”作为本标准的第3章"术语和定义”；附件2、附件3、附件4以及附件5分别对应本标准的附录A、附录B、附录C以及附录D。 本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。 本标准起草单位：江苏出人境检验检疫局、中国化工经济技术发展中心。 本标准主要起草人：王红松、汤礼军、刘君峰、王晓兵、戴雨幕。
-
-
1 GB/T27858-2011
引言
本标准用于评估化学品长期暴露对处在沉积物中的淡水双翅目摇蚊属（Chironomussp.）幼虫的影响。本标准主要以BBA标准为基础，使用一种沉积物-水系统，包括人造土壤和水柱体暴露场景1]，同时也借鉴了已有的对Chironomusriparius和Chironomustentans的毒性测试方法，上述摇蚊毒性试验方法已在欧洲和北美[2-8建立并通过了比对试验[15,9]。本标准也可使用其他已有充分实证的摇蚊种类,如 Chironomus yoshimatsuiluo-11。
本标准的暴露场景是将受试物质加人水中。应根据试验的应用目的选择适当的暴露场景。水暴露场景（包括将受试物加入水柱体中）是旨在模拟农药喷撒漂移的场景，同时也考虑到了间隙水中浓度的初始峰值。除了当累积过程的持续时间大于试验周期时，本标准对其他类型的暴露（包括化学物质出）也很有用。
要用沉积物中的生物测试的受试物质通常可在这个系统中存在很长时间。沉积物中的生物可通过多种途径暴露受试物质。每种暴露途径的相对重要性，以及每种暴露的时间对总体毒性效应的贡献，取决于相关化学品的理化特性。对于强吸附物质（如辛醇/水分配系数1gK。w>5的物质），或与沉积物共价结合的物质，让受试生物摄取加了受试物的食物可能是一条重要的暴露途径。为了不低估高亲脂性物质的毒性，可考虑在使用受试物之前向沉积物中加人饲料。为了将所有潜在的暴露途径纳人考虑之中，本标准将重点关注长期暴露。C.riparius和C.yoshimatsui的试验持续时间为20d～28d， C.tentans为28d～65d。如果因特殊目的，需要短期数据，例如研究不稳定化学品的毒性效应，可用附加的平行试样进行试验，并在10d后放弃。
试验的最终结果为羽化的成虫总数和羽化时间。如果需要额外的短期数据，建议只能适当增加额外的平行试验，在试验进行10d后，进行幼虫的存活和生长的测量。
本标准建议使用人工配制沉积物。与天然沉积物相比，配制沉积物有几个优点：
因为配制沉积物为可再生的“标准化基体”，减少了实验的不确定性，并且没必要去寻找未被污染的清洁沉积物来源；
—试验可在任何时候开始，而不必面对试验沉积物的季节性变化，也不必对沉积物进行预处理，
以去除本土动物群。使用配制沉积物也减少了去野外收集足量的用于常规试验的沉积物的相关费用；
一使用配制沉积物，使毒性数据可以相互比对，从而进行物质的毒性分类。
I GB/T27858—2011
化学品 沉积物-水系统中摇蚊毒性试验
加标于水法
1范围
本标准规定了加标于水法评估沉积物-水系统中摇蚊毒性的试验方法。 本标准适用于评估化学品长期暴露对于处在沉积物-水中的淡水双翅目摇蚊属（ChironomusSp.）
幼虫的影响。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T21809化学品蚓急性毒性试验
3术语和定义
下述术语和定义适用于本文件。
3. 1
配制沉积物formulatedsediment 用来模拟天然沉积物物理成分的混合物，也可称为再生沉积物、人工沉积物或合成沉积物。
3. 2
上覆水overlyingwater 试验容器中处于沉积物之上的水。
3.3
间隙水interstitialwaterorporewater 沉积物和土壤颗粒之间的水。
3. 4
加标水spikedwater 已经添加了受试物的试验用水。
4试验原理
将一龄摇蚊幼虫暴露于一系列含有不同浓度的受试物的沉积物-水系统中进行试验。试验开始时
将一龄摇蚊幼虫引人装有沉积物-水系统的烧杯，然后将受试物加人水中。试验结束时，测量摇蚊羽化数和发育的速率。如有需要，也可在10d后测量幼虫存活数和质量（使用适当的附加平行试样）。所测实验数据可用回归模型分析以估计导致羽化率或幼虫存活率或生长率下降%的浓度（如15%有效浓度ECi5，半数有效浓度ECs。等），或者用统计假设检验来测定无可观察效应浓度（NOEC)或者最低可观察效应浓度（LOEC)。后者需要用统计检验方法，以将效应值与对照值进行比较。
1 GB/T 27858-—2011
（粒度1mm），只能空气干燥。 一20%（千重）高岭黏土（高岭石含量最好大于30%）。 -75%～76%（干重）石英砂（以细砂为主，50%以上的石英砂颗粒应在50μm～200μm）。 ~一加人去离子水，使最终混合物中的水分含量为30%～50%。 加入化学纯碳酸钙（CaCO)将最终混合物的pH值调节至7.0士0.5。 一最终混合物中的有机碳含量应为2.0%士0.5%，可分别用适量的上述泥炭和石英砂调节。
8.3.2泥炭、高岭粘土和石英砂的来源应清楚。沉积物组分应经检查无化学污染（如重金属、有机氯化合物、有机磷化合物等）。附录B描述了配制沉积物的制备情况。如果能证实在加入上覆水后，不会发生沉积物组分的分离（如泥炭颗粒的漂起），并且泥炭或沉积物已充分陈化，也可以用干燥组分直接混合进行制备。 8.4水
附录A和附录C列出了可使用的稀释水的化学指标，任何符合这些指标的水均可作试验用水。在整个培育和试验过程中，如果摇蚊能够存活于其中而未显不适，则任何适宜的水，包括自然水（地表水）、 配制水（参见附录A)以及除氯的自来水等，都可用作培育用水和试验用水。试验开始时，试验用水的 pH值应在6.0～9.0之间，总硬度不大于400mg/L（以CaCO：计）。但是，如果怀疑硬度离子与试验物质之间有反应，则应使用硬度低一些的水（因此，在此情况下不能使用ElendtM4介质）。在整个试验过程中应自始至终使用同一类型的水。附录C中所列的水质特性指标每年至少应测定两次，当怀疑这些指标可能发生显著变化时，也应进行检测。 8.5储备液-加标水
试验浓度以水柱体（指位于沉积物之上的水体）浓度为基础计算。选定浓度的试验液通常是将备
液稀释制成。将受试物质溶解于试验介质中制成储备液；有时为了制备适宜浓度的储备液，可使用一些溶剂或分散剂。可选用的溶剂有：丙酮、乙醇、甲醇、乙二醇-乙醚乙酸酯、乙二醇-二甲醚、二甲基甲酰胺以及三乙撑乙二醇。可选用的分散剂有：聚氧乙烯醚（40）氢化葩麻油、吐温80、甲基纤维素0.01%和 HCO-4O。在最终的试验介质中，助浴剂浓度应尽可能低（如不天于0.1mL/L)并且在所有处理组中都一样。如果使用了助溶剂，应通过只有助溶剂的对照试验来确证助溶剂不会对摇蚊幼虫的存活产生影响或产生其他可观测到的不利影响。因此，应尽量不用助溶剂。
9试验设计
9.1总则
试验设计涉及选择试验浓度的组数以及浓度的间距（组距）、每个浓度的试验容器数和每个试验容
器中的幼虫数。应对EC点的估算、NOEC的估算，以及限度试验的设计进行描述。
9.2回归分析的设计 9.2.1效应浓度（如EC1s，ECso）和所关注的受试物质的效应浓度范围应包含在试验所用的浓度范围内。一般说来，当效应浓度处于试验浓度的范围内时，评估效应浓度（EC.）的准确性、特别是有效性可得到提高。应避免出现大大低于最低阳性浓度和大大高于最高浓度的情况。探寻浓度范围的预试验有助于选择拟采用的浓度范围。 9.2.2如需估计EC，应至少设置5组试验浓度，每个浓度3份平行试样。为使评估模型更为准确，试验的浓度应足够多。浓度间隔比例因子应不大于2（除非剂量响应曲线的斜率很小）。当不同响应的试
3 GB/T27858—2011
验浓度的个数增加时，可以减少每个浓度的平行试样的个数。增加平行试样个数或减小试验浓度的间隔可减小试验结果的置信区间。如果需要评估幼虫10d的存活和生长情况，则需增加额外的平行试样。 9.3评估NOEC/LOEC的设计
如需评估NOEC/LOEC，应设置5组试验浓度，每个浓度至少4个平行试样，浓度间隔比例因子不应大于2。为了保证足够的统计效能，以便在5%的显著水平上（力=0.05)检测出与对照组20%的差异，平行试样的个数应足够多。如需评估生长率，可用方差分析法（ANOVA），如Dunnett检验和 Williams检验等(16-19]。在进行羽化率评估时，可用Cochran-Armitage检验、Fisher精确检验（经 Bonferroni修正）或者Mantel-Haentzal检验。 9.4限度试验
如果在探寻浓度范围的预试验中没有观测到任何效应，则应进行限度试验（一个试验浓度和一个对照浓度）。限度试验的目的就是在一个足够高的浓度下进行试验，以使决策者能够排除该物质可能产生的毒性效应。限度值设定在一个预期在任何情况下都不会出现的浓度。推荐浓度为1000mg/kg（干重）。试验和对照各需至少6个平行试样。应证明试验有足够的统计效能，能够在5%的显著水平上 (p=0.05)检测出与对照组20%的差异。对于度量的效应结果（生长率和质量），如果数据满足t检验的要求（正态，齐性方差），则t检验是一种合适的统计方法。如果数据不能满足这些要求，可以应用方差不齐t检验，或者非参数检验，如Wilcoxon-Mann-Whithey检验。对于羽化率，则可用Fisher精确检验。
10试验步骤
10.1暴露条件 10.1.1加标水-沉积物系统的制备 10.1.1.1向试验容器中加入适当数量的配制沉积物，形成厚度至少1.5cm的一层，然后加入6cm深度的水。沉积物厚度与水深之比不应超过1：4，沉积层厚度不应超过3cm。加入受试生物之前，沉积物-水系统应进行7d的柔和通风（见附录B)。在向水柱体中加入试验溶液时，为了避免沉积物分层和再次激起微小颗粒悬浮在水中，可在沉积物上盖一个塑料片，把溶液倒在塑料片上然后迅速将塑料片移开。也可以用其他合适的器具。 10.1.1.2应在试验容器上加一个玻璃盘之类的盖子。必要时，试验过程中可加水使水深超过初始的体积以补偿水分的挥发。只能加入蒸馏水或电离水以避免盐分浓度增加。 10.1.2加入受试生物 10.1.2.1在向试验容器中加入受试生物的4d5d前，应将卵块从培养器中取出，移至加了培养介质的小容器中。可使用培养器中现成的已陈化介质，也可用新配制的介质。如果用后者，应向培养介质中加入绿藻，和/或几小滴将切片鱼食磨细后的悬浮液的滤出液。只能使用刚刚产出的卵块。正常情况下，卵出生2d～3d后幼虫就开始孵化(C.riparius，温度20℃情况下2d～3d;C.tentans，温度23℃情况下1d～4d;C.yoshimatsui，温度25℃情况下1d～4d)，幼虫至成虫共生长四龄，每龄4d～8d。用于试验的是一龄幼虫（孵出后2d～3d或1d～4d）。幼虫处于哪一龄可通过测量其头壳宽度来确定。 10.1.2.2用一根钝头吸管将20只龄幼虫随机放人每一个已加人加标水和沉积物的试验容器中。 向试验容器加入幼虫时停止通风，加入后再保持24h。每种浓度所加人的幼虫数量根据所使用的不同 GB/T27858—2011
的试验方法而定，用EC点估算法时每种浓度至少60只，而用NOEC测定法则至少为80只。 10.1.2.3加人幼虫24h后，将受试物质加入上部的水柱体中（用吸管向水面下注入少量的受试物质溶液），再次给予轻微的通风，以小心混合上部水体，注意不要搅起沉积物。 10.1.3试验浓度 10.1.3.1为了选定正式试验的浓度范围，可进行浓度范围的预试验；为此，需要使用一系列间隔较大的受试物质浓度。在与正式试验相同的摇蚊表面密度条件下，将摇蚊暴露于每一种试验物质浓度中一段时间，这样即可估算出适当的试验浓度。浓度范围的探寻试验不需要平行试样。 10.1.3.2正式试验用的试验浓度是根据探寻浓度范围的预试验的结果来决定，至少要选用5组浓度。 浓度的选定应与9.2和9.3的要求相符。 10.1.4对照
试验时要准备好对照容器，这些容器中不加人受试物质，但要加入沉积物。对照容器也要备好适当数量的平行试样（参见9.2和9.3）。如果在8.5使用了某种溶剂，则要增加沉积物溶剂对照。 10.1.5试验系统
应使用静态系统。在某些特殊的情况下，比如水质指标变得不再适合受试生物或者影响化学平衡时（例如：水中溶解的氧气含量过低，排泄物含量过高，或者从沉积物中析出的矿物质影响水的pH值或硬度时），也可使用半静态或流动系统：间断性或持续性地更新上部水体。尽管如此，通常情况下最好使用其他的改善上部水体质量的方法，比如通风；而避免使用半静态或流动系统。 10.1.6饲料
应及时给幼虫投食，最好每天一次或者每周至少三次。对于最初10d内的小幼虫，每条幼虫 0.25mg/d~0.5mg/d(C.yoshimatui应为0.35mg~0.5mg）的鱼饲料（一种水悬浮液或者磨碎的精细饲料，例如Tetra-Min或Tetra-Phyll,详见附录A)应足够了。对于大-些的幼虫，饲料应稍多些：在余下的试验中，每条幼虫0.5mg/d～1.0mg/d应足够了。如果发现真菌生长或者对照中观察到死亡率，则所有试验组和对照组中的饲料供给量应减少。如果不能停止真菌的生长，则试验应重做。当试验强吸附物质（例如1gK>5的物质）或者与沉淀物共价结合的物质时，应在陈化期前向配制沉积物中加人足量的饲料以确保幼虫的生存和自然生长。对此，应使用植物性饲料替代鱼饲料。例如，加人 0.5%（干重）的磨细的植物叶子，叶子来源于刺麻（Ulticadioeca）、桑树（Morusalba）、白三叶草（Trifoliumrepens）、菠菜（Spinaciaoleracea），或者其他植物原料（Cerophyl或者透明纤维素）。 10.1.7孵化条件 10.1.7.1加人幼虫24h后要给试验容器中的上覆水柔和通风，并且保持到试验结束（应注意溶解氧的浓度不得低于ASV的60%）。通风是通过固定在沉积层之上2cm～3cm处的一根玻璃巴斯德吸管进行的（即每秒1个或数个泡沫）。当试验挥发性化学物时，则不能给沉积物-水系统通风。 10.1.7.2试验要在20℃士2℃的恒温条件下进行。对于C.tentans和C.yoshimatui，推荐的温度分别是23℃和25℃±2℃。通常使用16h的光照周期，光照度应为5001x～10001x。 10.1.8暴露时间
暴露从幼虫加人加标容器和对照容器时就开始。C.riparius和C.yoshimatui的最长暴露时间是 28d,C.tentans是65d。如果蚊羽化较早，试验可在对照容器中最后一只成虫羽化之后的至少5d后结束。
5 ICS 13.300 A 80
C D
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化学品 沉积物-水系统中摇蚊毒性试验
加标于水法
Chemicals-Sediment-water chironomid toxicity test-Spiked water method
2012-08-01实施
2011-12-30发布
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中国国家标准化管理委员会 发布 GB/T27858—2011
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准与经济合作与发展组织（OECD)化学品测试导则219《化学品试验指南 沉积物-水系统中
摇蚊毒性试验加标于水法》(2004年4月）(英文版)技术性内容相同。
本标准做了下列结构和编辑性修改：
为与现有系列国家标准一致，将标准名称改为《化学品 沉积物-水系统中摇蚊毒性试验加标于水法》；一将OECD219中的“介绍”作为本标准的“引言”；将OECD219中的附件1“术语和定义”作为本标准的第3章"术语和定义”；附件2、附件3、附件4以及附件5分别对应本标准的附录A、附录B、附录C以及附录D。 本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。 本标准起草单位：江苏出人境检验检疫局、中国化工经济技术发展中心。 本标准主要起草人：王红松、汤礼军、刘君峰、王晓兵、戴雨幕。
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1 GB/T27858-2011
引言
本标准用于评估化学品长期暴露对处在沉积物中的淡水双翅目摇蚊属（Chironomussp.）幼虫的影响。本标准主要以BBA标准为基础，使用一种沉积物-水系统，包括人造土壤和水柱体暴露场景1]，同时也借鉴了已有的对Chironomusriparius和Chironomustentans的毒性测试方法，上述摇蚊毒性试验方法已在欧洲和北美[2-8建立并通过了比对试验[15,9]。本标准也可使用其他已有充分实证的摇蚊种类,如 Chironomus yoshimatsuiluo-11。
本标准的暴露场景是将受试物质加人水中。应根据试验的应用目的选择适当的暴露场景。水暴露场景（包括将受试物加入水柱体中）是旨在模拟农药喷撒漂移的场景，同时也考虑到了间隙水中浓度的初始峰值。除了当累积过程的持续时间大于试验周期时，本标准对其他类型的暴露（包括化学物质出）也很有用。
要用沉积物中的生物测试的受试物质通常可在这个系统中存在很长时间。沉积物中的生物可通过多种途径暴露受试物质。每种暴露途径的相对重要性，以及每种暴露的时间对总体毒性效应的贡献，取决于相关化学品的理化特性。对于强吸附物质（如辛醇/水分配系数1gK。w>5的物质），或与沉积物共价结合的物质，让受试生物摄取加了受试物的食物可能是一条重要的暴露途径。为了不低估高亲脂性物质的毒性，可考虑在使用受试物之前向沉积物中加人饲料。为了将所有潜在的暴露途径纳人考虑之中，本标准将重点关注长期暴露。C.riparius和C.yoshimatsui的试验持续时间为20d～28d， C.tentans为28d～65d。如果因特殊目的，需要短期数据，例如研究不稳定化学品的毒性效应，可用附加的平行试样进行试验，并在10d后放弃。
试验的最终结果为羽化的成虫总数和羽化时间。如果需要额外的短期数据，建议只能适当增加额外的平行试验，在试验进行10d后，进行幼虫的存活和生长的测量。
本标准建议使用人工配制沉积物。与天然沉积物相比，配制沉积物有几个优点：
因为配制沉积物为可再生的“标准化基体”，减少了实验的不确定性，并且没必要去寻找未被污染的清洁沉积物来源；
—试验可在任何时候开始，而不必面对试验沉积物的季节性变化，也不必对沉积物进行预处理，
以去除本土动物群。使用配制沉积物也减少了去野外收集足量的用于常规试验的沉积物的相关费用；
一使用配制沉积物，使毒性数据可以相互比对，从而进行物质的毒性分类。
I GB/T27858—2011
化学品 沉积物-水系统中摇蚊毒性试验
加标于水法
1范围
本标准规定了加标于水法评估沉积物-水系统中摇蚊毒性的试验方法。 本标准适用于评估化学品长期暴露对于处在沉积物-水中的淡水双翅目摇蚊属（ChironomusSp.）
幼虫的影响。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T21809化学品蚓急性毒性试验
3术语和定义
下述术语和定义适用于本文件。
3. 1
配制沉积物formulatedsediment 用来模拟天然沉积物物理成分的混合物，也可称为再生沉积物、人工沉积物或合成沉积物。
3. 2
上覆水overlyingwater 试验容器中处于沉积物之上的水。
3.3
间隙水interstitialwaterorporewater 沉积物和土壤颗粒之间的水。
3. 4
加标水spikedwater 已经添加了受试物的试验用水。
4试验原理
将一龄摇蚊幼虫暴露于一系列含有不同浓度的受试物的沉积物-水系统中进行试验。试验开始时
将一龄摇蚊幼虫引人装有沉积物-水系统的烧杯，然后将受试物加人水中。试验结束时，测量摇蚊羽化数和发育的速率。如有需要，也可在10d后测量幼虫存活数和质量（使用适当的附加平行试样）。所测实验数据可用回归模型分析以估计导致羽化率或幼虫存活率或生长率下降%的浓度（如15%有效浓度ECi5，半数有效浓度ECs。等），或者用统计假设检验来测定无可观察效应浓度（NOEC)或者最低可观察效应浓度（LOEC)。后者需要用统计检验方法，以将效应值与对照值进行比较。
1 GB/T 27858-—2011
（粒度1mm），只能空气干燥。 一20%（千重）高岭黏土（高岭石含量最好大于30%）。 -75%～76%（干重）石英砂（以细砂为主，50%以上的石英砂颗粒应在50μm～200μm）。 ~一加人去离子水，使最终混合物中的水分含量为30%～50%。 加入化学纯碳酸钙（CaCO)将最终混合物的pH值调节至7.0士0.5。 一最终混合物中的有机碳含量应为2.0%士0.5%，可分别用适量的上述泥炭和石英砂调节。
8.3.2泥炭、高岭粘土和石英砂的来源应清楚。沉积物组分应经检查无化学污染（如重金属、有机氯化合物、有机磷化合物等）。附录B描述了配制沉积物的制备情况。如果能证实在加入上覆水后，不会发生沉积物组分的分离（如泥炭颗粒的漂起），并且泥炭或沉积物已充分陈化，也可以用干燥组分直接混合进行制备。 8.4水
附录A和附录C列出了可使用的稀释水的化学指标，任何符合这些指标的水均可作试验用水。在整个培育和试验过程中，如果摇蚊能够存活于其中而未显不适，则任何适宜的水，包括自然水（地表水）、 配制水（参见附录A)以及除氯的自来水等，都可用作培育用水和试验用水。试验开始时，试验用水的 pH值应在6.0～9.0之间，总硬度不大于400mg/L（以CaCO：计）。但是，如果怀疑硬度离子与试验物质之间有反应，则应使用硬度低一些的水（因此，在此情况下不能使用ElendtM4介质）。在整个试验过程中应自始至终使用同一类型的水。附录C中所列的水质特性指标每年至少应测定两次，当怀疑这些指标可能发生显著变化时，也应进行检测。 8.5储备液-加标水
试验浓度以水柱体（指位于沉积物之上的水体）浓度为基础计算。选定浓度的试验液通常是将备
液稀释制成。将受试物质溶解于试验介质中制成储备液；有时为了制备适宜浓度的储备液，可使用一些溶剂或分散剂。可选用的溶剂有：丙酮、乙醇、甲醇、乙二醇-乙醚乙酸酯、乙二醇-二甲醚、二甲基甲酰胺以及三乙撑乙二醇。可选用的分散剂有：聚氧乙烯醚（40）氢化葩麻油、吐温80、甲基纤维素0.01%和 HCO-4O。在最终的试验介质中，助浴剂浓度应尽可能低（如不天于0.1mL/L)并且在所有处理组中都一样。如果使用了助溶剂，应通过只有助溶剂的对照试验来确证助溶剂不会对摇蚊幼虫的存活产生影响或产生其他可观测到的不利影响。因此，应尽量不用助溶剂。
9试验设计
9.1总则
试验设计涉及选择试验浓度的组数以及浓度的间距（组距）、每个浓度的试验容器数和每个试验容
器中的幼虫数。应对EC点的估算、NOEC的估算，以及限度试验的设计进行描述。
9.2回归分析的设计 9.2.1效应浓度（如EC1s，ECso）和所关注的受试物质的效应浓度范围应包含在试验所用的浓度范围内。一般说来，当效应浓度处于试验浓度的范围内时，评估效应浓度（EC.）的准确性、特别是有效性可得到提高。应避免出现大大低于最低阳性浓度和大大高于最高浓度的情况。探寻浓度范围的预试验有助于选择拟采用的浓度范围。 9.2.2如需估计EC，应至少设置5组试验浓度，每个浓度3份平行试样。为使评估模型更为准确，试验的浓度应足够多。浓度间隔比例因子应不大于2（除非剂量响应曲线的斜率很小）。当不同响应的试
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验浓度的个数增加时，可以减少每个浓度的平行试样的个数。增加平行试样个数或减小试验浓度的间隔可减小试验结果的置信区间。如果需要评估幼虫10d的存活和生长情况，则需增加额外的平行试样。 9.3评估NOEC/LOEC的设计
如需评估NOEC/LOEC，应设置5组试验浓度，每个浓度至少4个平行试样，浓度间隔比例因子不应大于2。为了保证足够的统计效能，以便在5%的显著水平上（力=0.05)检测出与对照组20%的差异，平行试样的个数应足够多。如需评估生长率，可用方差分析法（ANOVA），如Dunnett检验和 Williams检验等(16-19]。在进行羽化率评估时，可用Cochran-Armitage检验、Fisher精确检验（经 Bonferroni修正）或者Mantel-Haentzal检验。 9.4限度试验
如果在探寻浓度范围的预试验中没有观测到任何效应，则应进行限度试验（一个试验浓度和一个对照浓度）。限度试验的目的就是在一个足够高的浓度下进行试验，以使决策者能够排除该物质可能产生的毒性效应。限度值设定在一个预期在任何情况下都不会出现的浓度。推荐浓度为1000mg/kg（干重）。试验和对照各需至少6个平行试样。应证明试验有足够的统计效能，能够在5%的显著水平上 (p=0.05)检测出与对照组20%的差异。对于度量的效应结果（生长率和质量），如果数据满足t检验的要求（正态，齐性方差），则t检验是一种合适的统计方法。如果数据不能满足这些要求，可以应用方差不齐t检验，或者非参数检验，如Wilcoxon-Mann-Whithey检验。对于羽化率，则可用Fisher精确检验。
10试验步骤
10.1暴露条件 10.1.1加标水-沉积物系统的制备 10.1.1.1向试验容器中加入适当数量的配制沉积物，形成厚度至少1.5cm的一层，然后加入6cm深度的水。沉积物厚度与水深之比不应超过1：4，沉积层厚度不应超过3cm。加入受试生物之前，沉积物-水系统应进行7d的柔和通风（见附录B)。在向水柱体中加入试验溶液时，为了避免沉积物分层和再次激起微小颗粒悬浮在水中，可在沉积物上盖一个塑料片，把溶液倒在塑料片上然后迅速将塑料片移开。也可以用其他合适的器具。 10.1.1.2应在试验容器上加一个玻璃盘之类的盖子。必要时，试验过程中可加水使水深超过初始的体积以补偿水分的挥发。只能加入蒸馏水或电离水以避免盐分浓度增加。 10.1.2加入受试生物 10.1.2.1在向试验容器中加入受试生物的4d5d前，应将卵块从培养器中取出，移至加了培养介质的小容器中。可使用培养器中现成的已陈化介质，也可用新配制的介质。如果用后者，应向培养介质中加入绿藻，和/或几小滴将切片鱼食磨细后的悬浮液的滤出液。只能使用刚刚产出的卵块。正常情况下，卵出生2d～3d后幼虫就开始孵化(C.riparius，温度20℃情况下2d～3d;C.tentans，温度23℃情况下1d～4d;C.yoshimatsui，温度25℃情况下1d～4d)，幼虫至成虫共生长四龄，每龄4d～8d。用于试验的是一龄幼虫（孵出后2d～3d或1d～4d）。幼虫处于哪一龄可通过测量其头壳宽度来确定。 10.1.2.2用一根钝头吸管将20只龄幼虫随机放人每一个已加人加标水和沉积物的试验容器中。 向试验容器加入幼虫时停止通风，加入后再保持24h。每种浓度所加人的幼虫数量根据所使用的不同 GB/T27858—2011
的试验方法而定，用EC点估算法时每种浓度至少60只，而用NOEC测定法则至少为80只。 10.1.2.3加人幼虫24h后，将受试物质加入上部的水柱体中（用吸管向水面下注入少量的受试物质溶液），再次给予轻微的通风，以小心混合上部水体，注意不要搅起沉积物。 10.1.3试验浓度 10.1.3.1为了选定正式试验的浓度范围，可进行浓度范围的预试验；为此，需要使用一系列间隔较大的受试物质浓度。在与正式试验相同的摇蚊表面密度条件下，将摇蚊暴露于每一种试验物质浓度中一段时间，这样即可估算出适当的试验浓度。浓度范围的探寻试验不需要平行试样。 10.1.3.2正式试验用的试验浓度是根据探寻浓度范围的预试验的结果来决定，至少要选用5组浓度。 浓度的选定应与9.2和9.3的要求相符。 10.1.4对照
试验时要准备好对照容器，这些容器中不加人受试物质，但要加入沉积物。对照容器也要备好适当数量的平行试样（参见9.2和9.3）。如果在8.5使用了某种溶剂，则要增加沉积物溶剂对照。 10.1.5试验系统
应使用静态系统。在某些特殊的情况下，比如水质指标变得不再适合受试生物或者影响化学平衡时（例如：水中溶解的氧气含量过低，排泄物含量过高，或者从沉积物中析出的矿物质影响水的pH值或硬度时），也可使用半静态或流动系统：间断性或持续性地更新上部水体。尽管如此，通常情况下最好使用其他的改善上部水体质量的方法，比如通风；而避免使用半静态或流动系统。 10.1.6饲料
应及时给幼虫投食，最好每天一次或者每周至少三次。对于最初10d内的小幼虫，每条幼虫 0.25mg/d~0.5mg/d(C.yoshimatui应为0.35mg~0.5mg）的鱼饲料（一种水悬浮液或者磨碎的精细饲料，例如Tetra-Min或Tetra-Phyll,详见附录A)应足够了。对于大-些的幼虫，饲料应稍多些：在余下的试验中，每条幼虫0.5mg/d～1.0mg/d应足够了。如果发现真菌生长或者对照中观察到死亡率，则所有试验组和对照组中的饲料供给量应减少。如果不能停止真菌的生长，则试验应重做。当试验强吸附物质（例如1gK>5的物质）或者与沉淀物共价结合的物质时，应在陈化期前向配制沉积物中加人足量的饲料以确保幼虫的生存和自然生长。对此，应使用植物性饲料替代鱼饲料。例如，加人 0.5%（干重）的磨细的植物叶子，叶子来源于刺麻（Ulticadioeca）、桑树（Morusalba）、白三叶草（Trifoliumrepens）、菠菜（Spinaciaoleracea），或者其他植物原料（Cerophyl或者透明纤维素）。 10.1.7孵化条件 10.1.7.1加人幼虫24h后要给试验容器中的上覆水柔和通风，并且保持到试验结束（应注意溶解氧的浓度不得低于ASV的60%）。通风是通过固定在沉积层之上2cm～3cm处的一根玻璃巴斯德吸管进行的（即每秒1个或数个泡沫）。当试验挥发性化学物时，则不能给沉积物-水系统通风。 10.1.7.2试验要在20℃士2℃的恒温条件下进行。对于C.tentans和C.yoshimatui，推荐的温度分别是23℃和25℃±2℃。通常使用16h的光照周期，光照度应为5001x～10001x。 10.1.8暴露时间
暴露从幼虫加人加标容器和对照容器时就开始。C.riparius和C.yoshimatui的最长暴露时间是 28d,C.tentans是65d。如果蚊羽化较早，试验可在对照容器中最后一只成虫羽化之后的至少5d后结束。
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