ICS13.300 A 80
C D
8
中华人民共和国国家标准
GB/T27859—2011
化学品 沉积物-水系统中摇蚊毒性试验
加标于沉积物法
ChemicalsSediment-water chironomid toxicity test-
Spiked sediment method
2012-08-01实施
2011-12-30发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
发布 GB/T 27859-2011
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准与经济合作与发展组织（OECD)化学品测试导则218《沉积物-水系统中播蚊毒性试验 加
标于沉积物法》英文版)技术内容相同。
本标准做了下列结构和编辑性修改：一为与现有系列国家标准一致，将标准名称改为《化学品 沉积物-水系统中摇蚊毒性试验 加
标于沉积物法》；将OECD218中的“介绍”作为本标准的“引言”，
一
将OECD218中的附件1“术语和定义”作为本标准的第3章“术语和定义”。 本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。 本标准起草单位：江苏出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起章人：张军祖、陈会明、周秋红、徐炎、丁华、陆卫群。
1 GB/T 278592011
引言
本标准用于评估化学品长期暴露对处在沉积物中的淡水双翅目摇蚊属（Chironomussp.）幼虫的影响。它以已有的Chironomusriparius和Chironomustentans的毒性试验方法为基础，上述摇蚊毒性试验方法已在欧洲[1-3]和北美[4-8]建立并通过了比对试验[1,6,9]。本标准也可使用其他已有充分实证的播蚊种类，如Chironomusyoshimatsuil1o-uj。
应根据试验的应用目的选择适当的暴露场景。本标准中的暴露场景是在沉积物-水系统中将定量的受试物质添加于沉积物中，即加标于沉积物。该暴露场景用于模拟沉积物中存在的化学品的蓄积水平。
要用沉积物中的生物测试的受试物质通常可在这个系统中存在很长时间。沉积物中的生物可通过多种途径暴露受试物质。每种暴露途径的相对重要性，以及每种暴露的时间对总体毒性效应的贡献，取决于相关化学品的理化特性。对于强吸附物质（如1gK>5的物质），或与沉积物共价结合的物质，让受试生物摄取加了受试物的食物可能是一条重要的暴露途径。为了不低估高亲脂性物质的毒性，可考虑在使用受试物之前向沉积物中加人饲料。为了将所有潜在的暴露途径纳入考虑之中，本标准将重点关注长期暴露。C.riparius和C.yoshimatsui的试验持续时间为20d～28d，C.tentans为28d～65d。 如果因特殊目的，需要短期数据，例如研究不稳定化学品的毒性效应，可用附加的平行试样进行试验，并在10d后放弃。
试验的最终结果为羽化的成虫总数和羽化时间。如果需要额外的短期数据，建议只能适当增加额外的平行试验，在试验进行10d后，进行幼虫的存活和生长的测量。
本标准建议使用人工配制沉积物。与天然沉积物相比，配制沉积物有几个优点：一因为配制沉积物为可再生的“标准化基体”，减少了实验的不确定性，并且没必要去寻找未被污
染的清洁沉积物来源；试验可在任何时候开始，而不必面对试验沉积物的季节性变化，也不必对沉积物进行预处理，以去除本土动物群。使用配制沉积物也减少了去野外收集足量的用于常规试验的沉积物的相关费用；使用配制沉积物，使毒性数据可以相互比对，从而进行物质的毒性分类。
I GB/T27859—2011
化学品 沉积物-水系统中摇蚊毒性试验
加标于沉积物法
1范围
本标准规定了加标于沉积物法评估沉积物-水系统中摇蚊毒性的试验方法。 本标准适用于评估化学品长期暴露对于处在沉积物-水中的淡水双翅目摇蚊属（Chironomussp.）
幼虫的影响。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T21809化学品蚓急性毒性试验
3术语和定义
下述术语和定义适用于本文件。
3. 1
配制沉积物 formulated sediment 用来模拟天然沉积物物理成分的混合物，也可称为再生沉积物、人工沉积物或合成沉积物。
3.2
上覆水overlyingwater 试验容器中处于沉积物之上的水。
3.3
间隙水interstitialwaterorporewater 沉积物和土壤颗粒之间的水。
3. 4
加标沉积物 spikedsediment 已经添加了受试物的试验用沉积物。
4原理
将一龄摇蚊幼虫暴露于一系列含有不同浓度的受试物的沉积物-水系统中进行试验。先将受试物加人沉积物中，待烧杯中的沉积物和水陈化后，将一龄摇蚊幼虫引人烧杯。在试验结束时，测量摇蚊羽化数和发育速率。如果需要，也可在10d后测量存活幼虫数和质量（使用适当的附加平行试样）。所测实验数据可用回归模型分析，以估计导致羽化率或幼虫存活率或生长率下降工%的浓度（如15%有效浓度EC15，半数有效浓度ECsc等），或者用统计假设检验来测定无可观察效应浓度（NOEC)或者最低可观察效应浓度（LOEC)。后者需要用统计检验方法，以将效应值与对照值进行比较。
1 GB/T27859—2011
一4%～5%（干重）泥炭：pH值尽可能在5.5~6.0之间；重要的是应采用粉末状泥炭，研磨成粉
末（粒度≤1mm），只能空气于燥。 一20%（干重）高龄粘土（高岭石含量最好大于30%）。 —75%～76%（干重）石英砂（以细砂为主，50%以上的石英砂颗粒应在50μm～200μm）。
加人去离子水，使最终混合物中的水分含量为30%～50%。 一加人化学纯碳酸钙(CaCO）将最终混合物的pH值调节至7.0士0.5。
一最终混合物中的有机碳含量应为2.0%士0.5%，可分别用适量的上述泥炭和石英砂调节。
8.3.2泥炭、高岭粘土和石英砂的来源应清楚。沉积物组分应经检查无化学污染（如重金属、有机氟化合物、有机磷化合物等）。附录B描述了配制沉积物的制备情况。如果能证实在加人上覆水后，不会发生沉积物组分的分离（如泥炭颗粒的漂起），并且泥炭或沉积物已充分陈化，也可用干燥组分直接混合进行制备。 8.4水
附录A和附录C列出了可使用的稀释水的化学指标，任何符合这些指标的水均可作试验用水。在整个培育和试验过程中，如果播摇蚊能够存活于其中而未显不适，则任何适宜的水，包括自然水（地表水）、 配制水（参见附录A)以及除氯的自来水等，都可用作培育用水和试验用水。试验开始时，试验用水的 pH值应在6.0～9.0之间，总硬度不大于400mg/L（以CaCO：计）。但是，如果怀疑硬度离子与试验物质之间有反应，则应使用硬度低一些的水（因此，在此情况下不能使用ElendtM4介质，参见附录B）。 在整个试验过程中应自始至终使用同一类型的水。附录C中所列的水质特性指标每年至少应测定两次，当怀疑这些指标可能发生显著变化时，也应进行检测。 8.5储备液-加标沉积物
通常将受试物溶液直接加人沉积物中，以制备成选定浓度的加标沉积物。将受试物溶解于去离子水中制得储备液，再用振荡器、搅拌器或人工混合的方法将储备液与配制沉积物混合。如果受试物难溶于水，可将其溶于尽可能少的适宜有机溶剂中（如正已烷、丙酮或氟仿）；将此溶液与10g石英细砂混合，每10名石英砂适合一个试验容器的量；有机溶剂被挥发直室完全从石英砂中去除；再将该份石英砂与一个烧杯中的适量沉积物混合。只有易挥发性试剂才可以用来助溶、分散或乳化受试物。在配制沉积物时，应考虑由受试物与石英砂组成的混合物带人的右英砂的量（即在配制沉积物时应相应减少右英砂的用量）。注意应确保加入沉积物的受试物完全均匀地分布于沉积物中，必要时可分析副样以测定其均匀性。
9试验的设计
9.1总则
试验设计涉及选择试验浓度的组数以及浓度的间距（组距）、每个浓度的试验容器数和每个试验容器中的幼虫数。应对EC点的估算、NOEC的估算，以及限度试验的设计进行描述。
9.2回归分析的设计 9.2.1效应浓度（如EC15，EC50）和所关注的受试物质的效应浓度范围应包含在试验所用的浓度范围内。一般说来，当效应浓度处于试验浓度的范围内时，评估效应浓度（EC）的准确性、特别是有效性可得到提高。应避免出现大大低于最低阳性浓度和大大高于最高浓度的情况。探寻浓度范围的预试验有助于选择拟采用的浓度范围。
3 GB/T 27859—2011
9.2.2如需估计EC，应至少设置5组试验浓度，每个浓度3份平行试样。为使评估模型更为准确，试验的浓度应足够多。浓度间隔比例因子应不大于2（除非剂量响应曲线的斜率很小）。当不同响应的试验浓度的组数增加时，可以减少每个浓度的平行试样的组数。增加平行试样组数或减小试验浓度的间隔可减小试验结果的置信区间。如果需要评估幼虫10d的存活和生长情况，则需增加额外的平行试样。 9.3评估NOEC/LOEC的设计
如需评估NOEC/LOEC，应设置5组试验浓度，每个浓度至少4个平行试样，浓度间隔比例因子应不大于2。为了保证足够的统计效能，以便在5%的显著水平上（p=0.05)检测出与对照组20%的差异，平行试样的组数应足够多。如需评估生长率，可用方差分析法（ANOVA），如Dunnett检验和Wil- liams检验等[15-19]。在进行羽化率评估时，可用Cochran-Armitage检验、Fisher精确检验（经 Bonferroni修正）或者Mantel-Haentzal检验。 9.4限度试验
如果在探寻浓度范围的预试验中没有观测到任何效应，则可进行限度试验（一个试验浓度和一个对照浓度）。限度试验的目的就是在一个足够高的浓度下进行试验，排除该物质可能产生的毒性效应。限度值设定在一个预期在任何情况下都不会出现毒性浓度。推荐浓度为1000mg/kg（干重）。试验和对照各需至少6个平行试样。应证明试验有足够的统计效能，能够在5%的显著水平上（p=0.05）检测出与对照组20%的差异。对于度量的效应结果（生长率和质量），如果数据满足t检验的要求（正态，齐性方差），则t检验是一种合适的统计方法。如果数据不能满足这些要求，可以应用方差不齐t检验，或者非参数检验，如Wilcoxon-Mann-Whithey检验。对于羽化率，则可用Fisher精确检验。
10 试验步骤
10.1暴露条件 10.1.1加标沉积物-水系统的制备 10.1.1.1受试物的加人推荐参照GB/T21809中描述的加标步骤。将加标沉积物放入试验容器，再加人上覆水，形成一个体积比为1：4的沉积物-水系统（见8.1和8.4）。沉积层厚度应为1.5cm～ 3cm。在向水柱体中加人试验溶液时，为了避免沉积物分层和再次激起微小颗粒悬浮在水中，可在沉积物上盖一个圆形塑料片，把溶液倒在塑料片上，然后立即将塑料片移开。也可以用其他合适的器具。 10.1.1.2应在试验容器上加+个玻璃血之类的盖子。必要时，试验过程中可加水使水达到初始的体积以补偿水分的挥发。只能加入蒸馏水或去离子水以避免盐他增加。 10.1.2陈化
加标沉积物-水系统制备完成后，应让受试物在水相和沉积物中进行重新分配[3-4.6.13]。陈化应在与试验相同的温度和通风条件下进行。适宜的平衡时间取决于沉积物和化学品的特性，可能是数小时到数天，在罕见情况下可达几个星期（4周～5周）。由于长时间将导致许多化学品的降解，所以不必等待平衡出现，而建议将平衡时间定为48h，平衡期的后期，应检测受试物在上覆水、间隙水和沉积物中的浓度，至少要检测受试物在最高试验浓度和一个较低浓度的试验系统中的分布情况。这些对受试物质的分析测定结果可用于计算质量平衡，表述与实测浓度有关的检验结果。 10.1.3加入受试生物 10.1.3.1在向试验容器中加人受试生物的4d～5d前，应将卵块从培养器中取出，移至加了培养介质 4 GB/T27859—2011
的小容器中。可使用培养器中现成的已陈化介质，也可用新配制的介质。如果用后者，应向培养介质中加入绿藻，和/或几小滴将切片鱼食磨细后的悬浮液的滤出液（参见附录A）。只能使用刚刚产出的卵块。正常情况下，卵出生2d3d后幼虫就开始孵化C.riparius，温度20下2d～3d;C.tentans，温度23℃下1d～4d；C.yoshimatsui，温度25℃下1d～4d)，幼虫至成虫共生长四龄，每龄4d～8d。用于试验的是一龄幼虫（孵出后2d～3d或1d～4d)。幼虫处于哪一龄可通过测量其头壳宽度来确定。 10.1.3.2用-根钝头吸管将20只一龄幼虫随机放人每一个已含有加标沉积物和水的试验容器中。 向试验容器加人幼虫时，只能停止通风，加入后再保持24h。每种浓度所加入的幼虫数量根据所使用的不同试验设计而定，用EC点估算法时每种浓度至少60只，而用NOEC测定法则至少为80只。 10.1.4试验浓度 10.1.4.1为了选定正式试验的浓度范围，可进行浓度范围的预试验；为此，需要使用一系列间隔较大的受试物质浓度。在与正式试验相同的摇蚊表面密度条件下，将摇蚊暴露于每一种受试物质浓度中一段时间，这样即可估算出适当的试验浓度。浓度范围的预试验不需要平行试样。 10.1.4.2正式试验用的试验浓度是根据探寻浓度范围的预试验的结果来决定，至少要选用5种浓度。 浓度的选定应与9.2和9.3的要求相符。 10.1.5对照
试验时要准备好对照容器，这些容器中不加入受试物质，但要加人沉积物。对照容器也要备好适当
数量的平行试样（见9.2和9.3）。如果在8.5使用了某种溶剂，则要增加沉积物溶剂对照。 10.1.6试验系统
应使用静态系统。在某些特殊的情况下，比如水质指标变得不再适合受试生物或者影响化学平衡时（例如：水中溶解的氧气含量过低，排泄物含量过高，或者从沉积物中析出的矿物质影响水的pH值或硬度时），也可使用半静态或流动系统：间断性或持续性地更新上部水体。尽管如此，通常情况下最好使用其他的改善上部水体质量的方法，比如通风；而避免使用半静态或流动系统。 10.1.7饲料
应及时给幼虫投食，最好每天一次或者每周至少三次。对于最初10d内的小幼虫，每条幼虫 0.25mg/d~0.5mg/d(C.yoshimatui应为0.35mg~0.5mg）的鱼饲料（一种水悬浮液或者磨碎的精细饲料，例如Tetra-Min或Tetra-Phyll,详见附录A)应足够了。对于大一些的幼虫，饲料应稍多些：在余下的试验中，每条幼虫0.5mg/d～1.0mg/d应足够了。如果发现真菌生长或者对照中观察到死亡率，则所有试样和对照中的饲料供给量应减少。如果不能停止真菌的生长，则试验应重做。当试验强吸附物质（例如1gK。>5的物质）或者与沉淀物共价结合的物质时，应在陈化期前向配制沉积物中加人足量的饲料以确保幼虫的生存和自然生长。对此，应使用植物性饲料替代鱼饲料。例如，加人0.5% （干重）的磨细的植物叶子，叶子来源于刺萼麻（Ulticadioeca）、桑树（Morusalba）、白三叶草（Trifolium repens）、菠菜（Spinaciaoleracea），或者其他植物原料（Cerophyl或者透明纤维素）。 10.1.8孵化条件 10.1.8.1加人幼虫24h后要给试验容器中的上覆水柔和通风，并且保持到试验结束（应注意溶解氧的浓度不得低于ASV的60%）。通风是通过固定在沉积层之上2cm～3cm处的一根玻璃巴斯德吸管进行的（即每秒1个或数个泡沫）。当试验挥发性化学物时，则不能给沉积物-水系统通风。 10.1.8.2试验应在20℃士2℃的恒温条件下进行。对于C.tentans和C.yoshimatui，推荐的温度分别是23℃士2℃和25℃士2℃。通常使用16h的光照周期，光照度应为500lux1000lux。
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中华人民共和国国家标准
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化学品 沉积物-水系统中摇蚊毒性试验
加标于沉积物法
ChemicalsSediment-water chironomid toxicity test-
Spiked sediment method
2012-08-01实施
2011-12-30发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
发布 GB/T 27859-2011
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准与经济合作与发展组织（OECD)化学品测试导则218《沉积物-水系统中播蚊毒性试验 加
标于沉积物法》英文版)技术内容相同。
本标准做了下列结构和编辑性修改：一为与现有系列国家标准一致，将标准名称改为《化学品 沉积物-水系统中摇蚊毒性试验 加
标于沉积物法》；将OECD218中的“介绍”作为本标准的“引言”，
一
将OECD218中的附件1“术语和定义”作为本标准的第3章“术语和定义”。 本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。 本标准起草单位：江苏出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起章人：张军祖、陈会明、周秋红、徐炎、丁华、陆卫群。
1 GB/T 278592011
引言
本标准用于评估化学品长期暴露对处在沉积物中的淡水双翅目摇蚊属（Chironomussp.）幼虫的影响。它以已有的Chironomusriparius和Chironomustentans的毒性试验方法为基础，上述摇蚊毒性试验方法已在欧洲[1-3]和北美[4-8]建立并通过了比对试验[1,6,9]。本标准也可使用其他已有充分实证的播蚊种类，如Chironomusyoshimatsuil1o-uj。
应根据试验的应用目的选择适当的暴露场景。本标准中的暴露场景是在沉积物-水系统中将定量的受试物质添加于沉积物中，即加标于沉积物。该暴露场景用于模拟沉积物中存在的化学品的蓄积水平。
要用沉积物中的生物测试的受试物质通常可在这个系统中存在很长时间。沉积物中的生物可通过多种途径暴露受试物质。每种暴露途径的相对重要性，以及每种暴露的时间对总体毒性效应的贡献，取决于相关化学品的理化特性。对于强吸附物质（如1gK>5的物质），或与沉积物共价结合的物质，让受试生物摄取加了受试物的食物可能是一条重要的暴露途径。为了不低估高亲脂性物质的毒性，可考虑在使用受试物之前向沉积物中加人饲料。为了将所有潜在的暴露途径纳入考虑之中，本标准将重点关注长期暴露。C.riparius和C.yoshimatsui的试验持续时间为20d～28d，C.tentans为28d～65d。 如果因特殊目的，需要短期数据，例如研究不稳定化学品的毒性效应，可用附加的平行试样进行试验，并在10d后放弃。
试验的最终结果为羽化的成虫总数和羽化时间。如果需要额外的短期数据，建议只能适当增加额外的平行试验，在试验进行10d后，进行幼虫的存活和生长的测量。
本标准建议使用人工配制沉积物。与天然沉积物相比，配制沉积物有几个优点：一因为配制沉积物为可再生的“标准化基体”，减少了实验的不确定性，并且没必要去寻找未被污
染的清洁沉积物来源；试验可在任何时候开始，而不必面对试验沉积物的季节性变化，也不必对沉积物进行预处理，以去除本土动物群。使用配制沉积物也减少了去野外收集足量的用于常规试验的沉积物的相关费用；使用配制沉积物，使毒性数据可以相互比对，从而进行物质的毒性分类。
I GB/T27859—2011
化学品 沉积物-水系统中摇蚊毒性试验
加标于沉积物法
1范围
本标准规定了加标于沉积物法评估沉积物-水系统中摇蚊毒性的试验方法。 本标准适用于评估化学品长期暴露对于处在沉积物-水中的淡水双翅目摇蚊属（Chironomussp.）
幼虫的影响。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T21809化学品蚓急性毒性试验
3术语和定义
下述术语和定义适用于本文件。
3. 1
配制沉积物 formulated sediment 用来模拟天然沉积物物理成分的混合物，也可称为再生沉积物、人工沉积物或合成沉积物。
3.2
上覆水overlyingwater 试验容器中处于沉积物之上的水。
3.3
间隙水interstitialwaterorporewater 沉积物和土壤颗粒之间的水。
3. 4
加标沉积物 spikedsediment 已经添加了受试物的试验用沉积物。
4原理
将一龄摇蚊幼虫暴露于一系列含有不同浓度的受试物的沉积物-水系统中进行试验。先将受试物加人沉积物中，待烧杯中的沉积物和水陈化后，将一龄摇蚊幼虫引人烧杯。在试验结束时，测量摇蚊羽化数和发育速率。如果需要，也可在10d后测量存活幼虫数和质量（使用适当的附加平行试样）。所测实验数据可用回归模型分析，以估计导致羽化率或幼虫存活率或生长率下降工%的浓度（如15%有效浓度EC15，半数有效浓度ECsc等），或者用统计假设检验来测定无可观察效应浓度（NOEC)或者最低可观察效应浓度（LOEC)。后者需要用统计检验方法，以将效应值与对照值进行比较。
1 GB/T27859—2011
一4%～5%（干重）泥炭：pH值尽可能在5.5~6.0之间；重要的是应采用粉末状泥炭，研磨成粉
末（粒度≤1mm），只能空气于燥。 一20%（干重）高龄粘土（高岭石含量最好大于30%）。 —75%～76%（干重）石英砂（以细砂为主，50%以上的石英砂颗粒应在50μm～200μm）。
加人去离子水，使最终混合物中的水分含量为30%～50%。 一加人化学纯碳酸钙(CaCO）将最终混合物的pH值调节至7.0士0.5。
一最终混合物中的有机碳含量应为2.0%士0.5%，可分别用适量的上述泥炭和石英砂调节。
8.3.2泥炭、高岭粘土和石英砂的来源应清楚。沉积物组分应经检查无化学污染（如重金属、有机氟化合物、有机磷化合物等）。附录B描述了配制沉积物的制备情况。如果能证实在加人上覆水后，不会发生沉积物组分的分离（如泥炭颗粒的漂起），并且泥炭或沉积物已充分陈化，也可用干燥组分直接混合进行制备。 8.4水
附录A和附录C列出了可使用的稀释水的化学指标，任何符合这些指标的水均可作试验用水。在整个培育和试验过程中，如果播摇蚊能够存活于其中而未显不适，则任何适宜的水，包括自然水（地表水）、 配制水（参见附录A)以及除氯的自来水等，都可用作培育用水和试验用水。试验开始时，试验用水的 pH值应在6.0～9.0之间，总硬度不大于400mg/L（以CaCO：计）。但是，如果怀疑硬度离子与试验物质之间有反应，则应使用硬度低一些的水（因此，在此情况下不能使用ElendtM4介质，参见附录B）。 在整个试验过程中应自始至终使用同一类型的水。附录C中所列的水质特性指标每年至少应测定两次，当怀疑这些指标可能发生显著变化时，也应进行检测。 8.5储备液-加标沉积物
通常将受试物溶液直接加人沉积物中，以制备成选定浓度的加标沉积物。将受试物溶解于去离子水中制得储备液，再用振荡器、搅拌器或人工混合的方法将储备液与配制沉积物混合。如果受试物难溶于水，可将其溶于尽可能少的适宜有机溶剂中（如正已烷、丙酮或氟仿）；将此溶液与10g石英细砂混合，每10名石英砂适合一个试验容器的量；有机溶剂被挥发直室完全从石英砂中去除；再将该份石英砂与一个烧杯中的适量沉积物混合。只有易挥发性试剂才可以用来助溶、分散或乳化受试物。在配制沉积物时，应考虑由受试物与石英砂组成的混合物带人的右英砂的量（即在配制沉积物时应相应减少右英砂的用量）。注意应确保加入沉积物的受试物完全均匀地分布于沉积物中，必要时可分析副样以测定其均匀性。
9试验的设计
9.1总则
试验设计涉及选择试验浓度的组数以及浓度的间距（组距）、每个浓度的试验容器数和每个试验容器中的幼虫数。应对EC点的估算、NOEC的估算，以及限度试验的设计进行描述。
9.2回归分析的设计 9.2.1效应浓度（如EC15，EC50）和所关注的受试物质的效应浓度范围应包含在试验所用的浓度范围内。一般说来，当效应浓度处于试验浓度的范围内时，评估效应浓度（EC）的准确性、特别是有效性可得到提高。应避免出现大大低于最低阳性浓度和大大高于最高浓度的情况。探寻浓度范围的预试验有助于选择拟采用的浓度范围。
3 GB/T 27859—2011
9.2.2如需估计EC，应至少设置5组试验浓度，每个浓度3份平行试样。为使评估模型更为准确，试验的浓度应足够多。浓度间隔比例因子应不大于2（除非剂量响应曲线的斜率很小）。当不同响应的试验浓度的组数增加时，可以减少每个浓度的平行试样的组数。增加平行试样组数或减小试验浓度的间隔可减小试验结果的置信区间。如果需要评估幼虫10d的存活和生长情况，则需增加额外的平行试样。 9.3评估NOEC/LOEC的设计
如需评估NOEC/LOEC，应设置5组试验浓度，每个浓度至少4个平行试样，浓度间隔比例因子应不大于2。为了保证足够的统计效能，以便在5%的显著水平上（p=0.05)检测出与对照组20%的差异，平行试样的组数应足够多。如需评估生长率，可用方差分析法（ANOVA），如Dunnett检验和Wil- liams检验等[15-19]。在进行羽化率评估时，可用Cochran-Armitage检验、Fisher精确检验（经 Bonferroni修正）或者Mantel-Haentzal检验。 9.4限度试验
如果在探寻浓度范围的预试验中没有观测到任何效应，则可进行限度试验（一个试验浓度和一个对照浓度）。限度试验的目的就是在一个足够高的浓度下进行试验，排除该物质可能产生的毒性效应。限度值设定在一个预期在任何情况下都不会出现毒性浓度。推荐浓度为1000mg/kg（干重）。试验和对照各需至少6个平行试样。应证明试验有足够的统计效能，能够在5%的显著水平上（p=0.05）检测出与对照组20%的差异。对于度量的效应结果（生长率和质量），如果数据满足t检验的要求（正态，齐性方差），则t检验是一种合适的统计方法。如果数据不能满足这些要求，可以应用方差不齐t检验，或者非参数检验，如Wilcoxon-Mann-Whithey检验。对于羽化率，则可用Fisher精确检验。
10 试验步骤
10.1暴露条件 10.1.1加标沉积物-水系统的制备 10.1.1.1受试物的加人推荐参照GB/T21809中描述的加标步骤。将加标沉积物放入试验容器，再加人上覆水，形成一个体积比为1：4的沉积物-水系统（见8.1和8.4）。沉积层厚度应为1.5cm～ 3cm。在向水柱体中加人试验溶液时，为了避免沉积物分层和再次激起微小颗粒悬浮在水中，可在沉积物上盖一个圆形塑料片，把溶液倒在塑料片上，然后立即将塑料片移开。也可以用其他合适的器具。 10.1.1.2应在试验容器上加+个玻璃血之类的盖子。必要时，试验过程中可加水使水达到初始的体积以补偿水分的挥发。只能加入蒸馏水或去离子水以避免盐他增加。 10.1.2陈化
加标沉积物-水系统制备完成后，应让受试物在水相和沉积物中进行重新分配[3-4.6.13]。陈化应在与试验相同的温度和通风条件下进行。适宜的平衡时间取决于沉积物和化学品的特性，可能是数小时到数天，在罕见情况下可达几个星期（4周～5周）。由于长时间将导致许多化学品的降解，所以不必等待平衡出现，而建议将平衡时间定为48h，平衡期的后期，应检测受试物在上覆水、间隙水和沉积物中的浓度，至少要检测受试物在最高试验浓度和一个较低浓度的试验系统中的分布情况。这些对受试物质的分析测定结果可用于计算质量平衡，表述与实测浓度有关的检验结果。 10.1.3加入受试生物 10.1.3.1在向试验容器中加人受试生物的4d～5d前，应将卵块从培养器中取出，移至加了培养介质 4 GB/T27859—2011
的小容器中。可使用培养器中现成的已陈化介质，也可用新配制的介质。如果用后者，应向培养介质中加入绿藻，和/或几小滴将切片鱼食磨细后的悬浮液的滤出液（参见附录A）。只能使用刚刚产出的卵块。正常情况下，卵出生2d3d后幼虫就开始孵化C.riparius，温度20下2d～3d;C.tentans，温度23℃下1d～4d；C.yoshimatsui，温度25℃下1d～4d)，幼虫至成虫共生长四龄，每龄4d～8d。用于试验的是一龄幼虫（孵出后2d～3d或1d～4d)。幼虫处于哪一龄可通过测量其头壳宽度来确定。 10.1.3.2用-根钝头吸管将20只一龄幼虫随机放人每一个已含有加标沉积物和水的试验容器中。 向试验容器加人幼虫时，只能停止通风，加入后再保持24h。每种浓度所加入的幼虫数量根据所使用的不同试验设计而定，用EC点估算法时每种浓度至少60只，而用NOEC测定法则至少为80只。 10.1.4试验浓度 10.1.4.1为了选定正式试验的浓度范围，可进行浓度范围的预试验；为此，需要使用一系列间隔较大的受试物质浓度。在与正式试验相同的摇蚊表面密度条件下，将摇蚊暴露于每一种受试物质浓度中一段时间，这样即可估算出适当的试验浓度。浓度范围的预试验不需要平行试样。 10.1.4.2正式试验用的试验浓度是根据探寻浓度范围的预试验的结果来决定，至少要选用5种浓度。 浓度的选定应与9.2和9.3的要求相符。 10.1.5对照
试验时要准备好对照容器，这些容器中不加入受试物质，但要加人沉积物。对照容器也要备好适当
数量的平行试样（见9.2和9.3）。如果在8.5使用了某种溶剂，则要增加沉积物溶剂对照。 10.1.6试验系统
应使用静态系统。在某些特殊的情况下，比如水质指标变得不再适合受试生物或者影响化学平衡时（例如：水中溶解的氧气含量过低，排泄物含量过高，或者从沉积物中析出的矿物质影响水的pH值或硬度时），也可使用半静态或流动系统：间断性或持续性地更新上部水体。尽管如此，通常情况下最好使用其他的改善上部水体质量的方法，比如通风；而避免使用半静态或流动系统。 10.1.7饲料
应及时给幼虫投食，最好每天一次或者每周至少三次。对于最初10d内的小幼虫，每条幼虫 0.25mg/d~0.5mg/d(C.yoshimatui应为0.35mg~0.5mg）的鱼饲料（一种水悬浮液或者磨碎的精细饲料，例如Tetra-Min或Tetra-Phyll,详见附录A)应足够了。对于大一些的幼虫，饲料应稍多些：在余下的试验中，每条幼虫0.5mg/d～1.0mg/d应足够了。如果发现真菌生长或者对照中观察到死亡率，则所有试样和对照中的饲料供给量应减少。如果不能停止真菌的生长，则试验应重做。当试验强吸附物质（例如1gK。>5的物质）或者与沉淀物共价结合的物质时，应在陈化期前向配制沉积物中加人足量的饲料以确保幼虫的生存和自然生长。对此，应使用植物性饲料替代鱼饲料。例如，加人0.5% （干重）的磨细的植物叶子，叶子来源于刺萼麻（Ulticadioeca）、桑树（Morusalba）、白三叶草（Trifolium repens）、菠菜（Spinaciaoleracea），或者其他植物原料（Cerophyl或者透明纤维素）。 10.1.8孵化条件 10.1.8.1加人幼虫24h后要给试验容器中的上覆水柔和通风，并且保持到试验结束（应注意溶解氧的浓度不得低于ASV的60%）。通风是通过固定在沉积层之上2cm～3cm处的一根玻璃巴斯德吸管进行的（即每秒1个或数个泡沫）。当试验挥发性化学物时，则不能给沉积物-水系统通风。 10.1.8.2试验应在20℃士2℃的恒温条件下进行。对于C.tentans和C.yoshimatui，推荐的温度分别是23℃士2℃和25℃士2℃。通常使用16h的光照周期，光照度应为500lux1000lux。
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