ICS 75.160.20 CCS E 31
SH
中华人民共和国石油化工行业标准
NB/SH/T 6053—2022
燃料、燃料/水混合物和燃料罐底水中微生物的三磷酸腺苷（ATP）含量的测定
Standard test method for adenosine triphosphate (ATP) content of microorganisms in fuel, fuel/water mixtures, and fuel associated water
2022-05-13发布
2022-11-13实施
国家能源局发布 NB/SH/T6053—2022
前言
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任本文件由中国石油化工集团有限公司提出。 本文件由全国石油产品和润滑剂标准化技术委员会石油燃料和润滑剂分技术委员会（SAC/TC280/
SC1）归口。
本文件起草单位：中国石油化工股份有限公司石油化工科学研究院、北京中检葆泰生物技术有限公司、河北大学
本文件主要起草人：蔺建民、刘龙飞、葛欣、夏鑫、李妍、李宝石、陶志平、高岚。
I NB/SH/T6053—2022
燃料、燃料/水混合物和燃料罐底水中微生物的
三磷酸腺苷（ATP）含量的测定
警示：本文件的使用可能涉及某些有危险的材料、操作及设备，但并未对所有的安全问题提出建议。因此，用户在使用本文件前应建立适当的安全防护措施，并确定相关规章限制的适用性。
1范围
本文件描述了采用生物发光酶法测定燃料、燃料/水混合物和燃料罐底水中微生物的三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）含量的方法。
本文件适用于液体燃料（见附录A）、燃料/水混合物和燃料罐底水中ATP含量的测定。本文件包括方法A和方法B，方法A使用HY-LiTE检测棒，检测范围为1×10-"mol/L~3×10-°mol/LATP；方法B使用WaterGiene检测棒，检测范围为1×10-13mol/L~1×10-7mol/LATP。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件是必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T4756石油液体手工取样法 ASTMD4012水中微生物的三磷酸腺苷含量的测量方法（Standardtestmethodforadenosinetriphos-
phate（ATP）contentof microorganismsinwater)
ASTMD7464用于微生物测试的液体燃料、相关材料和燃料系统组件的手动采样的标准规范 (Standard practice for manual sampling of liquid fuels, associated materials and fuel system components for mi- crobiological testing)
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3. 1
无菌aseptic 无活的微生物污染。
3. 2
生物发光bioluminescence 活的生物体在化学能转化为光能的化学反应中，产生并发出光信号。
3. 3
生物质biomass 除化石燃料外，任何活性有机体或其组分或产品的生物材料。
3.4
捕获溶液 capture solution 用于从液体燃料中捕获和浓缩ATP的专有水溶液。
1 NB/SH/T6053—2022
3.5
细胞内ATPcellularadenosinetriphosphate（cellular-ATP）存在于微生物细胞中的ATP。 注：在样品制备过程中，微生物细胞发生裂解，释放出ATP。被微生物污染的液体同时含有细胞内ATP（细胞相
关/细胞结合）和细胞外ATP。
3. 6
细胞外ATP extracellularATP 不包含在细胞内的ATP。 注：在细胞死亡和裂解时ATP会释放到环境中，例如，当细胞暴露于某些杀菌剂时可释放ATP。释放到环境中的
ATP在细胞裂解后可以存在几天。因此，活细胞相关（生物量相关）ATP的浓度为总ATP与细胞外ATP之差。
3.7
游离水freewater 以分离相存在的水。 注：燃料如烃类柴油燃料中存在的水，可以以悬浮雾状、不可见的悬浮液滴存在，如管道壁上的液滴，或以管道、
样品容器底部的分离层存在。
3.8
亲水粒子hydrophilicparticles 常分散或分布在原油、植物油、汽油和煤油等疏水液体基质的化合物，如ATP、氧化型烟酰胺腺
嘌呤二核苷酸（NAD*）、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP*）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、酶、游离脂肪酸、防腐剂、杀菌剂、盐类以及微生物或其他物质。 3. 9
荧光素酶 每luciferase 可以催化生物发光反应的酶的通称。
3. 10
荧光素 luciferin 生物发光的有机生物体中的一类发光的生物色素的通称。
3. 11
光度计luminometer 测量由于非热激发而发出的光的仪器。
3.12
相对发光单位 relativelightunit(RLU) 测量由荧光素-荧光素酶催化的ATP水解为AMP和焦磷酸盐释放的光子数的单位，其单位设定为RLU。 注：RLU不是国际单位，但RLU数值与活体ATP浓度成正比。
4方法概要
从燃料样品中捕获微生物ATP，浓缩成待测样品，利用生物发光反应进行测试。由光度计测量生物发光反应产生的光，其强度与样品中ATP的量成正比
注：对于本测试方法，待测样品是从燃料系统样品中抽提出的水相，用于测定细胞和/或细胞外ATP的存在。如果
燃料系统样品是纯燃料，无燃料罐底水，则待测样品为捕获溶液抽提出的水相。如果燃料系统样品含有燃料罐底水，则待测样品是捕获溶液抽提出的水相和燃料罐底水的混合物。
5方法应用
5.1本方法用于测量样品中ATP的浓度。ATP是包括细菌和真菌在内的所有活细胞的组成部分，与 2 NB/SH/T60532022
非生命物质无关。因此，ATP可作为判断燃料系统中微生物污染的可靠指标。当进行状态监测或诊断测试时，需要从可能形成由微生物引起的沉积或过滤器堵塞问题的燃料中取得样品。 5.2本方法提供一种从化学干扰中快速分离ATP的方法，这些干扰因素能够影响含烃类和其他有机分子的液体混合燃料的ATP检测，以及使用独立的检测棒和光度计捕获、提取和定量测定燃料（石油）样品、燃料/水混合样品、燃料罐底水样品中的ATP以及燃料或含水样基质中细胞外游离ATP的方法。 方法A一般不超过10min，方法B不超过2min。 5.3本方法在实验室或者室外环境中具有同样的稳定性。
注：尽管生物发光测试是经技术验证的可靠方法，但无法区分ATP来自细菌还是真菌，但仍可用于估算活菌量
评价杀菌剂的有效性，监测燃料存储和分配系统中微生物污染的状况
5.4本方法的检测结果可用于进行微生物污染的评价和趋势分析，样品的相对发光单位（RLU）越高，表明污染越严重。
6干扰
6.1取样容器和取样装置应干净、无ATP和微生物污染 6.2确保ATP检测棒上的采样拭子不接触任何污染表面。与表面或物质接触会造成ATP含量过高，从而导致错误结果。 6.3荧光素酶是一种酶，高温、重金属和高盐能够抑制其活性或使其变性。对于有可能抑制荧光素酶活性的样品，可以按照7.7.1进行样品稀释。
7方法A——HY-Lite方法
7.1试剂和材料
除非另有说明，仅使用分析纯及以上纯度试剂。 7.1.1无ATP水：市售医药级无热原水。 7.1.2ATP二钠盐。 7.1.3燃料微生物检测棒：见图1左。 7.1.4游离ATP检测棒：见图1右。
捕获溶液和储液池
样品拭子
含缓冲液的小皿
冻干荧光试剂
图1HY-LiTE燃料检测棒（左）和游离ATP检测棒（右）示意图
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注：HY-LiTE燃料检测棒属于符合本文件要求的市售耗材。为了检测细胞内ATP，Merck公司HY-LiTE燃料检测
棒需要配合游离ATP检测棒使用。此提示旨在方便标准使用，无任何指定或授权含义。
7.1.5一次性巴斯德移液器：1.0mL、10.0mL，无菌，聚乙烯材质。 7.1.6乙醇溶液：体积分数为75%的乙醇水溶液。 7.2仪器和设备 7.2.1光度计：能够在540nm波长下工作，图2为光度计示意图。
注：MerckHY-LiTe检测仪（或更新型号）属于符合本文件要求的市售仪器。此提示旨在方便标准使用者，无任何
指定或授权含义。 警告：本设备无防爆设计，不应在爆炸性环境或可能存在爆炸性气体的地方操作，因为仪器不能
接地。
电池
光路
少温度补偿样品孔
电源接口
图2光度计示意图
7.2.2样品瓶：圆形广口，容量500mL或1000mL，高密度聚乙烯或同等材质。
注：当含有500mL或1000mL样品时，顶部至少保留10%的剩余空间，便于充分混合捕获溶液。 7.2.3移液器：固定体积或可调，能够不连续量取罐底水的体积。移液器体积包括10μL、50μL和 100 μL。 7.3取样 7.3.1按照ASTMD7464要求取样，并装人干净的500mL样品瓶。 7.3.2航空燃料按相应的维修手册进行取样，并装入干净的1000mL样品瓶。 7.3.3为降低意外污染的风险，用于微生物检测的样品不得用于其他检测。 7.3.4取样时，样品可能发生交叉污染。为了减少潜在的交叉污染风险，需用75%乙醇水溶液清洗采样设备和样品容器并风于。所有装置（工厂新生产的、干净的瓶子除外）都应该以这种方式消毒，以减少交叉污染的可能性。将样品加人容器前，快速打开容器盖，不要触摸刚消毒的采样设备或样品瓶内部，并在加入样品后尽快盖上容器盖。 7.3.5微生物污染是动态的。在取样和检测的时间间隔内，样品中的细菌可能增殖或死亡。因此，应在采样24h内进行检测。 7.3.6如果样品采集4h后进行测试，则应将样品置于冰中或在0℃~7℃的冰箱中保存直至测试。 避免冷冻样本。测试前，将样品恢复至室温。
7.4校准和标准化 7.4.1本文件专用的光度计出厂时已进行校准和温度补偿，在5℃~35℃下的线性响应值为0RLU~ 9.9×10*RLU。仪器启动时自动进行校准检查。 7.4.2根据附录B中的标准曲线，可将RLU数据换算为ATP浓度，1RLU约相当于5×10-15gATP。 4 NB/SH/T6053—2022
7.5样品准备 7.5.1按照7.3.1或7.3.2的要求采集样品。 7.5.1.1对于纯燃料，将500mL样品加人干净的样品瓶（7.2.2）中进行检测。 7.5.1.2对于燃料/水混合物或水，将400mL~500mL样品加人干净的样品瓶（7.2.2）中进行检测。 7.5.1.3对于航空燃料，将1000mL样品加人干净的样品瓶（7.2.2）中进行检测。 7.5.1.4如果样品总体积大于500mL，则将500mL样品转移到干净的样品瓶（7.2.2）中。 7.5.2从燃料检测试剂盒中取出小移液器。 7.5.3用干净的工具剪开塑料保护套的球头处，取出移液器。不可用手或其他物体接触吸管的尖端和杆下部。 7.5.4使用无菌小移液器，将捕获溶液从燃料检测棒的储液池中转移到含有样品的样品瓶 (7.2.2)中。 7.5.5用样品冲洗移液器内部，确保最大限度地将捕获溶液转移到样品中。 7.5.6按相关规定将移液器作为被燃料污染的固体废弃物处理。 7.5.7盖上样品瓶的盖子，剧烈振荡30s。 7.5.8将样品瓶置于水平桌面上，静置5min。
注：捕获溶液易溶于燃料罐底水或只有水的样品。样品中水的存在会导致稀释后的捕获溶液颜色变浅。深色或浑注
样品可能使捕获溶液变色，但不影响结果的测定。
7.5.9从燃料检测试剂盒中取出大移液器，用干净的工具剪开塑料保护套的球头处，取出移液器。不可用手或其他物体接触吸管的尖端和杆下部。 7.5.10将捕获液和所有水相合并，使用大移液器移取并转移样品到燃料检测棒的储液池中。 7.5.11样品捕获液的液面至少应达到取样管的碗形底部。如果采样管中燃料过量（可见燃料超过蓝色相1mm以上），检测前使用同一移液器移除多余燃料。 7.6试验步骤 7.6.1盖上采样管储液池的盖子。将游离ATP采样拭子从采样管中取出，露出无菌的白色采样拭子。 不可用手触摸采样拭子或接触任何表面。 7.6.2打开燃料检测棒的盖子，将采样拭子浸人样品捕获液中，直到接触管底。 7.6.3将取样管和储液池竖直放置，小心地将采样拭子从储液池中取出，不要让采样拭子触碰取样管的侧壁。 7.6.4保持检测棒竖直，采样拭子向下。不要摇晃检测棒。捕获溶液应彻底地沉积于采样拭子下半部分的所有脊线之间。
注1：如果样品捕获液中含有过量的燃料，在蓝色液体中会出现白色或苍白色的“斑块”。 注2：如果有燃料，将采样拭子再次浸人捕获液，并上下移动几次，然后取出采样拭子。这通常会冲洗掉大部分的
燃料相，并确保捕获液明显地显现在采样拭子的所有脊线上。
7.6.5白色采样拭子向下，握紧笔筒，将采样拭子尖端垂直压在坚硬、平整的表面上，直至采样拭子完全缩回检测管内。 7.6.6按下并顺时针转动白色笔芯，直到拧紧，以激活检测棒。 7.6.7用拇指和食指握住样品杯，摇动10s~20s。
注：为了使检测管中的冻干试剂完全复原和混合，充分摇动检测棒至关重要。如果开始测定后几分钟内，光信号强度随时间的推移而增加，表明混合不充分。
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7.6.8取下可能在直接接触样品的步骤中戴过的手套，以防止将检测棒插人光度计时产生静电。 7.6.9将检测棒放入光度计的样品室内，盖上盖子开始读数。
注：需要提前打开光度计电源，使其完成自检。检测棒激活后立即测量光信号。约15s后显示结果，仪器盖子
打开。
7.6.10记录细胞外ATP（RLU外）数值。
按照7.6.1~7.6.10步骤使用燃料检测棒检测总ATP数值，记录RLU总。
7.6.11
注1：对于纯燃料样品，RLU与500mL样品中含有的悬浮水或小水滴中的微生物活性有关。 注2：对于燃料/水混合物或仅有水的样品，RLU与从样品瓶的水层获得的1mL待测样品中的微生物活性有关。 注3：对于航空燃料样品，RLU结果与1000mL样品中的微生物有关。
7.6.12取出检测棒并按相应规定处置。 7.7结果计算 7.7.1如果检测结果大于99999RLU或怀疑存在样品基质干扰，则将100μL底水或之前测试过的样品捕获液直接加入新的燃料检测棒（7.1.3）储液池中的捕获溶液中，盖上盖子，反转混匀，制备11 倍稀释的溶液。如果需要，可以通过减少转移到储液池1.0mL捕获溶液中的样品体积来制备更高倍数的稀释液，例如，用50μL进行21倍稀释，用10μL进行101倍稀释。
按照公式（1）对稀释结果进行校正。
RLU=［（RLU唇-b）×D]+b
.. (1)
式中： RLU-——样品的修正结果； RLU标——稀释液的检测结果；
D稀释因子。如果样品1：11稀释，则D=11； b——平均试剂背景读数。如果不测量试剂背景读数，可以将其设置为20。 计算结果保留3位有效数字。 参照7.6分别测定总RLU（RLU）和细胞外ATP（RLU外），按照公式（2）确定细胞内ATP（RLU）。
RLU肉=RLU总－RLU外
（2
.
计算结果保留3位有效数字。 7.8精密度
7.8.1概述
本方法精密度是在两个实验室，采用不同的仪器，分别选取样品进行实验室间协作试验。按照 GB/T6683的规定，对试验结果进行统计计算得到的。按照下述规定判断试验结果的可靠性（95%置信水平)。 7.8.2重复性（r)
同一实验室、同一操作者、使用同一台仪器、按照相同的方法、对同一试样连续测得的两个试验结果之差不应超过表1相关公式的计算值。 7.8.3再现性（R)
不同实验室、不同操作者、使用不同的仪器，对同一试样测得两个单一、独立的试验结果之差不应超过表1相关公式的计算值。 6