第33卷，第7期 2013年7月
摘要
光谱学与光谱分析 Spectroscopy and Spectral Analysis
光谱法表征蛋白酶K的热变性过程
张奇兵，那馨竹，尹宗宁*
四川大学华西药学院靶向药物与释药系统教育部重点实验室，四川成都
561004
Vol.33,No.7;pp1749-1753
July,2013
用不同温度处理蛋白酶K，以变性酪蛋白底物法测定酶活力，稳态/瞬态荧光光谱法和圆二色谱法
测定空间构象和二级结构，研究温度对蛋白酶K酶活力和构象的影响。温度由25℃升高至65C过程中，蛋白酶K的酶活力逐断降低，半衰期缩短；发射光谱荧光强度降低，峰位由335nm红移至354nm；色氨酸残基同步荧光强度降低，酪氨酸残基同步荧光强度增大；色氮酸残基荧光寿命由4.4271ns降低至4.0324 ns；α螺旋百分含量降低。结果表明：采用稳态/脱态荧光光谱法和圆二色谱法能较简便、准确的描述蛋白酶 K的热稳定性变化；蛋白酶K的热变性过程符合三态模型，存在个中间态；蛋白酶K分子内部存在酪氨酸残基对色氨酸残基的共振能量转移作用；α螺旋是维系蛋白酶K活性中心构象稳定性的主要结构。
关键词蛋白酶K；热稳定性：稳态荧光光谱；瞬态荧光光谱；圆二色谱中图分类号：Q55
文献标识码：A
引言
DOI: 10, 3964/j. issn. 1000-0593(2013)07-1749-05
对蛋白质的生产、储存以及在医药和工业上的应用具有--定指导意义，
随着蛋白多肽类药物的不断发展，溶液中蛋白质的稳定性越来越被人们所重视，常见的影响因素有温度、pH、变性剂、有机溶剂、压力、离子强度等(")。对蛋白质变性和去折叠过程的研究有助于从深层次了解蛋白质的稳定性[1.3]。
蛋白酶K(EC3.4.21.64)来源于林伯氏白色念珠菌，属于丝氮酸蛋白酶家族。该酶具有较强的蛋白水解活性，常用于诊断既病毒病、分离纯化DNA/RNA时去除DNA/
RNA酶、添加到洗衣粉中降解污溃蛋白等[56]
。酶活性中心
由催化三联体Asp39-His69-Ser224组成，底物识别和结合部
位由G100-Y104和S132-G136两个片段构成[6)
蛋白酶K
仅有一条肽链，由277个氨基酸残基组成，
分子量为
28930Da；含有两个二硫键（34-124，179-248），
trp-212)和17个酪氨酸残基[4]
残基(trp-8，1
两个色氨酸
Liu[S]等研究了Ca*+对蛋白酶K的影响；Tomar等[]研究了烷基醇对部分去折叠态蛋白酶K的影响；Pechkova 等[对蛋白酶K的辐射稳定性进行了研究。目前对蛋白酶K 热变性过程尚无较为深人的研究，本工作采用稳态/瞬态荧光光谱法和圆二色谱法，从分子水平上研究了不同温度诱导蛋白酶K的去折叠过程和酶活力变化，并尝试阐明构象与醇活力的关系，为蛋白质分子的去折叠研究提供了理论基础，
收稿日期：2012-12-03，修订日期：2013-02-25
基金项目：国家自然科学基金项目(30973659)资助
作者简介：张奇兵，1987年生，四川大学华西药学院硕士研究生
*通讯联系人
万方数据
e-meil, yzn@seu, edu, cn
实验部分 1.1
试剂与仪器
蛋白酶K（sigma）；酪蛋白（solarbio）；酪氨酸（solarbio）；三氟乙酸（天津市科密欧化学试剂有限公司)；三羟甲基氮基甲烷(广东光华化学厂有限公司)。
UV1000紫外可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司)；RF-5301PC荧光分光光度计（SHIMADZU)；FL SP920型稳态/瞬态荧光光谱仪（EDINBUGH)；MODEL400 圆二色光谱仪（AVTV)；GENIUS16K-M台式微量高速离心机(长沙市鑫奥仪器仪表有限公司)；LabDancer(IKA）) BS124S型电子天平（SATORIUS)；BT25S型电子天平（SA TORIUS); Five Easy pH 计(METTLER TOLEDO); MP
501A型超级恒温循环槽（上海一恒科技有限公司）。 1.2
方法
1.2.1
不同温度对蛋白酶K酶活力的影响
蛋白酶K浓度为0.1mg，ml,1，于25，35，45，50， 55，60和65℃保温不同时间后取出，25℃水浴冷却5min，按下述方法测定酶活力。
以变性酪蛋白为底物测定蛋白酶K的酶活力；取10
e-mail; zhangqibing163de@163, com