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高效液相色谱法测定血浆中5种小檗碱型生物碱
宁浩辰
(哈尔滨商业大学药学院，黑龙江哈尔滨150076)
摘
要：日的：建立准确，可信的方法，适用HPLC测定血浆中5种小案碱型生物碱。方法：色谱条件为：C18色语柱（50mm×
2.1mm，1.7μm）；流动相（水：乙睛=430:570，每升KH;PO44g，SDS2.5g），流建1.0ml/min；检测波长345nm。储备液用甲醇稀释10、100、 500、1000，2000，5000，10000，20000倍。然后将以上7份溶液分别加入9倍体积的大鼠空自血浆中，得7份样品用于线性考察实验。储备液用分别用甲醇稀释100倍，300倍，50000倍。再取储务液用甲醇稀释10信，30倍，500信，再分别取样加入到9倍体积的大鼠空白血浆中，所得样本用于精密度、回收率和稳定性考察实验。血浆样本处理：120μ1血浆加入空白EP管中，移液格量取120μ1乙晴加入血浆，涡截3分钟，以13000r/min离心10min，取上清进样分析，进样体积100μ1。结果：各生物碱在色谱图中的专属性良好，小案碱回归方程为 y=2.9E+5x+1975.2,r2=0.9993,巴马汀回归方程为y=3.8E+5x3160.5,r2=0.9991，黄连减闻归方程y=3.2E+5x1791.4,t2=0.9991,表小碱回归方程为y=4.2E+5x-3412.1，r2=0.9992，药根碱回归方程为v=3.3E+5x-2678.6，r2=0.9992。线性均良好，精密度，稳定性的RSD值均在可接受范图内。
关键词：小染碱；巴马汀；药根碱；表小巢碱；黄连碱;HPLC
黄连其有清热媒湿，泻火解毒的功效。传统中医药中的对黄连的运用有：内治肝火旺盛、湿热瘤满、呕吐春酸、泻菊、黄殖、高热神香、心火亢盛心烦不廉、血热吐幅、目赤、牙痛等症，还可外治痛肿疗疮，湿参，湿疮，耳道流脉等症。黄连中主要成分为小巢减型生物减，其中小巢贼是黄连中含量最高的生物碱，也是最能代表黄连药物活性成分，而巴马汀、黄连碱、药根碱、表小檗碱也是黄连中的主要成分，它们与小檗碱一起可较为全面的反应黄连的药效、及药动学特征。然面目前鲜有文献报道运用高效液相色谱法回时测定口服黄连后生物血浆中小檗碱、巴马汀、黄连碱、药
根贼、表小聚碱这5种生物碱的实验方法。本次研究，旨在建立这样一种可信度高、重现性好的检测方法。
1材料
1.1药材与试剂
十二烷基磺酸钠（色谱纯，Sigma），磷酸二氢钾（色谱纯天津市科密欧化学试剂有限公司)，甲醇（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司），乙睛（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司），磷酸（分析纯，天津天力化学试剂有限公司），无水乙醇（分析纯，天津基准化学试剂有限公司），娃哈哈纯净水。本实验用标准品（成都斯特曼科技有限公司生产与中国科学院生物研究所)：盐酸小巢碱(含量9895%)，盐酸巴马汀（含量≥98%),黄连碱（含量含98%），表小碱（含量含98%），盐酸药根碱（含量98%)
1.2仪器
Waterse2695高效液相色谱仪，Waters2998发光二极管阵列检测器，柱温箱，WatersC18色谱柱(50mm×2.1mm，1.7μm)，精密PH计，电子天平），台式离心机，超声清洗器，快速混匀器，循环水真空。
2方法
2.1标准品以及方法学实验样品的准备
分析天平分别称取标准品小集碱231mg，巴马汀1.99mg，重
黄连碱
5.14mg，表小巢碱2.11mg，药根碱2.27mg，然后用甲醇溶解各标准品，每个标准品溶液均定容至1ml。合并混匀5中标准品溶液，得标准品储备液，-20℃保存。取储备液，分别用甲醇稀释10,100.500 1000,2000,5000，10000,20000倍。然后将以上7份落液分别加入9借体积的大鼠空白血浆中，得7份样品用于线性考察实验。取储备液，分别用甲醇稀释100借，300倍，50000倍。再取储备液，分别用甲醇稀释10 借，30倍，500借，再分别取样加人到9倍体积的大鼠空白血浆中，所得样本用于精密度、回收率和稳定性考察实验。
2.2血浆样本的处理
用移液枪吸取120μ1血浆加人空白EP管中，移液枪量取120μ1 乙晴加人血浆.涡旋3分钟，以13000r/min高心10min，取上清进样分析，进样体积100=1
2.3色谱条件：
Cx色谱柱(50mm×21mm,1.7μm);流动相水：乙晴=430570,每升KH,PO。4g.SDS2.5g).流速1.0ml/min；检测波长345nm
2.4专属性与线性考察实验
取大鼠空白血浆分两份，一份按21法加人稀释后的混标储备液，另份不加人任何成分。按22法处理这两份血浆进样分析，根据色谱图考察专属性。根据预实验结果，得小巢碱定量范围：4.5-0002μg/ml，巴马汀
(a)(b)
图1空白血浆(a)和含5种生物碱样品的血浆(b)的HPLC图定量范围：4.0-0.002μg/ml，黄连碱：100.005μg/ml，表小巢威： 4.5-0.002μg/ml，药根碱：4.5-0.002μg/ml。于是在此线性范用内，按照2.1 法制备7个不同浓度血浆的样本，并按22法处理进样，并根据所测得的峰面积和浓度确定线性回归方程，以考案线性关系，
25精密度考察实验
根据上述5种生物碱的定量范围，按照2.1法制备高、中、低三个浓度的血浆样本，各浓度平行五个样本，按2.1法处理并进样分析。连续测定5 天。根据测得的浓度确定RSD值，以考察日内和日间精密度
26回收率和稳定性考察实验
按照21法制备高、中、低三个浓度的血浆样本，各浓度平行5个样本，按22法处理血浆样本并进样分析，所测得的浓度与实际稀释所得浓度的比值为回收率，并计算每个浓度的回收率平均值和RSD值。
按照21法制备两组高、中、低三个浓度的血浆样本，测定新鲜配制出的样本浓度后，一组样本于4C冷藏24h后测定其浓度，另一组样本于-20C冷藏30天后测定浓度。根据所测浓度与原始浓度的差异确定样品的稳定性
2.7数据处理
本实验数据运用Exel表格进行处理。 3结果
3.1专属性和线性
比较大鼠空白血浆和加人混标后大鼠血浆样本的色谱图，见图1，发现血浆对各生物减的吸收峰无影响，专属性良好。
根据测得的7个不同浓度点的样品浓度以及峰面积，
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