研究报告
中国酿造
2012年第31卷第5期
总第242期
甲基营养型芽孢杆菌产氨肽酶的发酵优化
向军"，张金虎！浆海云"，陈伟滨，崔堂兵*
（1.华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州510006;2.广东环西生物科技股份有限公司，广东普宁515300）
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摘要：氨肽酶能从多肽链的N端顺序水解并释放氨基酸，广泛应用于食品、工业、医学等领域。该研究利用单因素试验、正交试验及响应面设计试验方法，优化了甲基营养型芽孢杆菌（Bacillusmethylotrophilus)CC发酵产氨肽酶的条件，其发酵最佳培养基组成为 1%蓝、1.5%黄豆饼粉、0.1%氯化钠、0.05%确酸二氢钾和0.02%硫酸铁。最适发酵条件为初始pH值为8.5，发酵醇温度37，摇床转速 180r/min，接种量6%，发酵时间15h，在上述条件下，氮肽酶的产量从优化前的83.09U/mL提高为310.05U/mL，比优化前增加了2.73倍。关键调：甲基营养型芽瘤杆菌：氨肽酶：发酵：优化
中图分类号：Q815
文献标识码：A
文章编号：02545071(2012)05004505
Fermentation optimization for aminopeptidase production of Bacillus methylotrophilus
XIANG Jun', ZHANG Jinhu', CHAI Haiyun', CHEN Weibin', CUI Tangbing**
(I.School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China;
2.Guangdong Huanxi Biological Technology Co., Ltd, Puning 515300, China)
Abstract: Aminopeptidase can hydrolyse polypeptide chain to amino acids from N-terminal, so it is applied in the fields of food, industry and medicine. This study optimized fermentation conditions for arminopeptidase production of Bacillus methylotrophilus CC by One-factor experimental design, Orthogonal experimental design and Response surface experimental design. The result showed that the optimal compositions of media were 1% sucrose, 1.5% soybean cake meal, 0.1% sodium chloride, 0.05% potassium d-ihydrogen phosphate and 0.02% magnesium sulfate heptahydrate; the optimal culture conditions were pH value 8.5, temperature 37°C, rotating speed 180r/min, inoculum 6%, culture time 15h. Under above-mentioned
conditions, the highest yield of aminopeptidase reached 310.07U/ml and increased by 2.73 times, compared with 83.09U/ml before optimization. Key words: Bacillus methylotrophilus, aminopeptidase; fermentation; optimization
氨肽酶是一类从多肽链的N端顺序水解氨基酸、使氨基酸逐个游离出来的酶，能水解多肽和完整的蛋白质分子。氨肽酶不仅存在于高等动物的胰脏、肠液中，而且广泛分布于多种真菌、细菌和原生动物体内，一些真菌和细菌的种类还能向胞外分泌这种酶。其催化作用的机理可以用以下反应式表示：
R,
R
NH,-CH-CO-NH-CH-CO-
氨肽醇
R.
R
+NH,-CH-COOH+NH,-CH-CO-
氨肽酶的种类很多，不同的氨肽酶对N端氨基酸残基的水解能力表现差异性。同一种氨肽酶对不同的N端氨基酸残基的水解能力也不同。氨肽酶的作用范围一般都较为广谱，根据最适反应底物的不同可分为亮氨酸氨肽酶、缬氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶、脯氨酸氨肽酶等，其可切除苦味肽氨端的疏水氨基酸从而脱除苦味25)，蛋白质的深度水解、生物活性肽的制备、医学解毒剂等。亮氨酸氨肽酶（1eucineaminopeptidase，LAP)是一类对亮氨酸残基切割效率最高的氨肽酶的总称，通常表现出较为广泛的底物特异性。由于其底物、结构的特异性以及分布的广泛性，LAP已成为氨肽酶家族中最典型的代表69。
甲基营养菌（Methylotrophy)又称为甲基利用菌，是类能够利用非C-C键低碳化合物(如甲烷、甲醇、甲醛、甲
收稿日期：2012-01-14
基金项目：广东省教育部产学研项目（2010B090400225）
酸、甲基胺类等)的微生物，具有一些特殊的代谢途径，如丝氨酸循环。近年的研究表明，甲基营养细菌具有重要的商业用途，可以进行单细胞蛋白、氨基酸、胞外多糖。另外，甲基营养杆菌还可以用来工业化生产各种辅酶(辅酶 Q10)、维生素(VBs)和聚-β-基丙酮等。许多已知的甲基营养菌都具有专一性，其不利用任何包含C-C键的化合物。然而，在能利用甲醇的细菌中，也有许多可以在多碳化合物或一碳(C1)化合物上生长。分离到一株能够产生氨肽酶的兼性甲基营养型细菌（Facultativemethylotrophs）。经鉴定，该菌株为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophilus)，命名其为BacillusmethylotrophilusCC。
1材料与方法 1.1菌种
本实验室从豆豉中分离的甲基营养型芽孢杆菌CC，
斜面保藏于4℃冰箱中。 1.2 培养基
斜面培养基：可溶性淀粉0.2g，干酪素0.1g蛋白陈0.5g，牛肉膏0.2g，琼脂2g，溶于100mL蒸馏水中，pH值为7.0。
种子培养基：营养肉汤培养基：蛋白陈1g,牛肉膏0.5g， NaCI0.5g，蒸馅水100mL.pH值7.2±0.2。
基础发酵培养基：麦芽糖0.2g,蛋白陈1.5g,MgSO7H,O
作者简介：向军（1987-)，男，硕士研究生，研究方向为发醇工程；崔堂兵*，副教投，通讯作者。