SN ICS 65.020.20 CCS B 16
中华人民共和国出入境检验疫行业标准
SN/T 4723——2022 代替SN/T 4723——2016
根结线虫属（中国种类）检疫鉴定方法Detection and identification of Meloidogyne spp.(Chinese species)
2022-07-07发布
2023-02-01实施
发 布
中华人民共和国海关总署
SN/T 4723—2022
根结线虫属（中国种类）检疫鉴定方法
1 范围
本文件规定了根结线虫中国种类检疫鉴定方法，以及根结线虫中国种和非中国种的判定。本文件适用于进出境植物、植物产品、土壤和介质等传带的根结线虫中国种的鉴定。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；凡不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 24829 毛刺线虫属（传毒种类）检疫鉴定方法SN/T 2117 伪哥伦比亚根结线虫检疫鉴定方法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
阴门裂长 vulval slit length 雌虫阴门横裂缝的宽度。3.2
肛阴距 anus to vulva distance 肛门和阴门的距离。3.3
会阴花纹 perineal pattern
雌虫近尾部阴门和肛门周围所形成的线纹。3.4
透明尾 hyaline tail
2龄幼虫近尾端较透明（看不到虫体内容物）区域的长度。3.5
中国种 Chinese species
包括以下2类：1）中国最早报道的新种；2）中国已有过报道的种类，且次数较多，有充分的描述，鉴定结果也被大家认可。3.6
非中国种 non-Chinese species
包括以下3类：1）中国未曾报道过的种；2）中国已有过报道，但次数较少，且描述不充分，需要进一步核实；3）已确认有分布，但分布未广并进行官方防控。SN/T 4723—2022
4 符号和缩略语
下列符号和缩略语适用于本文件。n————虫体数量；
L————虫体体长（mm或μm）；a————体长/最大体宽；
b————体长/虫体前端至食道与肠连接处的距离；b'——体长/虫体前端至食道腺末端的距离；c———体长/尾长；c’———尾长/肛门处体宽；St.———口针长度（μm）；sp.———交合刺长度（μm）；Gub.———引带长度（μm）；
V———虫体前端至阴门的距离×100/体长；T————泄殖腔口至精巢先端的距离×100/体长；DGO———背食道腺开口到口针基球的距离。
5 根结线虫属线虫基本信息和鉴定原理
5.1 基本信息
学名：Meloidogyne Goeldi，1887。英文名：Root-knot nematodes。
分类地位：据Perry和Moens（2003）提出的分类系统，其分类地位为小杆线虫目（Rhabditida），垫刃线虫亚目（Tylenchina），垫刃线虫总科（Tylenchoidea），根结线虫科（Meloidogynidae），根结线虫亚科（Meloidogyninae），根结线虫属（Meloidogyne）。
传播途径：带线虫根组织、球根、球茎和被污染的土壤都是根结线虫传播的主要载体。远距离传播主要借助于受侵染的植物繁殖材料的调运；农事操作中农机具和人员等的黏带以及灌溉和风雨运动可造成近距离扩散。
根结线虫属其他相关信息参见附录A。
根结线虫属为植物根系、球根、球茎等地下组织的专性内寄生线虫，其寄主及分布范围均十分广泛。目前该属已知线虫105种，其中最常见的是南方根结线虫 M，incognita、花生根结线虫M，arenaria、爪哇根结线虫M.javanica 和北方根结线虫M.hapla。5.2 鉴定原理
根结线虫2龄幼虫线形，在根及根围土壤中活动，入侵寄主根部后固着寄生，逐渐发育为卵圆形雌虫，导致寄主根部膨大呈根瘤状。因此，如发现疑似根结，可直接剖检获得雌虫，也可从寄主植物根系及根围土壤或介质中分离获得2龄幼虫或雄虫。可根据2龄幼虫或雄虫形态，判别其是否为根结线虫属。如用形态学特征进行鉴定，应尽量找齐雌、雄虫和2龄幼虫等3种虫态，然后进一步用形态学和（或）分子生物学相结合的方法，并参考其寄主、地理分布等信息，判断其种类。
中国种分两类：一类是指中国报道的新种，此类线虫为中国首次报道，明确属于中国种，如奇异根结线虫M.aberrans Ye，Xu，Yuan，Wang，Lin，Zhuo &.Liao，2017等17种为我国报道的新种。另一类是中国已经广为报道的种类（一般3次以上），并且其描述较为充分，分布较为广泛，鉴定结果也被大家认可，包括花生根结线虫 M，aremaria（Neal，1889）Chitwood，1949、拟禾本科根结线虫 M.graminicola Golden &.Birchfield，1965、禾本科根结线虫M.grarninis（Sledge&Golden，1964）Whitehead，1968、北方根结线虫 M.hapla Chitwood，1949、西班牙根结线虫 M.hispanica Hirschmann，1986、南方根结线虫M.incognita（Kofoid&White，1919）Chitwood，1949、爪哇根结线虫M.javanica（Treub，1885）Chitwood，1949和悬铃木根结线虫M，platani Hirschmann，1982等8种。上述根结属线虫中国种共计25种（参见附录B）。
此外，还有甘蓝根结线虫M，artiellia Franklin，1961、短尾根结线虫 M， brewicanda Loos，1953、光纹根结线虫M，decalineata Whitchead，1968、短小根结线虫M.exigna Goldi，1887、印度根结线虫M，indica Whitehead，1968、喜久屋根结线虫M.kikuyensis De Grisse，1961、苹果根结线虫 M.mali Itoh，Ohshima&.Ichinohe，1969、巨针根结线虫M.megadora Whitehead，1968、小球根结线虫M.microtyla Mulvey，Townshend&.Potter，1975、摩洛哥根结线虫M.morocciensis Rammah &.Hirschmann，1990、纳西根结线虫 M，naasi Franklin，1965、奥蒂法根结线虫 M，oteifai Elmiligy，1968、奥特森结线虫M. ottersoni（Thome，1969）Franklin，1971、卵形根结线虫M.ovalis Riffle，1963、萨拉斯根结线虫M. salasi Lopez，1984、杉并根结线虫M.suginamiensis Toida&Yaegashi，1984和塔吉克斯坦根结线虫M.tadshikistanica Kirjanova &.Ivanova，1965等17种根结线虫属线虫在中国有过报道，但次数很少，其描述不充分，是否为中国种有待进一步核实，暂作为根结线虫非中国种。
6 器材和试剂
6.1 仪器设备和器具
PCR 仪、冷藏箱、体视显微镜、生物显微镜、超低温冰箱、恒温金属浴、离心机、漩涡振荡器、电泳仪、凝胶成像系统、高压灭菌锅、微波炉、烘箱、贝尔曼漏斗、医用解剖刀、载玻片、盖玻片、酒精灯、线虫挑针、PCR管、24孔血细胞培养板、可调式微量移液器（2μL～1000μL）及相应的吸头。6.2 主要试剂
除特别规定外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T 6682中相关规定。
甲醛、乙醇、甘油、蜡块、指甲油、2×Tor MasterMix 预混液、10×EasyTag Buffer、蛋白酶K （20 mg/mL）、无 RNase无菌水、100 bp Marker、Gelred染料、50×TAE溶液、琼脂糖凝胶。
7 现场检疫与取样
7.1 症状检查
现场检疫时应挖取寄主植物根部，观察根上是否有根结或疙瘩状变异，或生长不良、腐烂、变色、畸形等症状。7.2 取样
按照SN/T2117进行抽样和取样，对有根结等症状的重点取样。如无症状，则随机取样。对于进境苗木，如数量≤5株，要求对每株单独取1份样品。每份样品重量≥0.5kg，取样深度为20cm左右，要求多带些根。数量>5株，则要求取样5份以上。样品置密闭塑料袋中，标明品名、报检号、来源国、检测要求等信息，及时送实验室检测。如小苗带土较少，则尽可能多取根和土样，不带土的苗应仔细检查根部。土壤、介质或其他植物产品可参照该方法。