SN ICS 65.020.20 CCS B 16
中华人民共和国出入境检验疫行业标准
SN/T 5551—2022
夜来香花叶病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Telosma mosaic virus
2022-07-07发布
2023-02-01实施
中华人民共和国海关总署发布
SN/T 5551—2022
夜来香花叶病毒检疫鉴定方法
1 范围
本文件规定了夜来香花叶病毒的血清学和分子生物学检测方法。本文件适用于进出境植物及其产品中夜来香花叶病毒的检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 夜来香花叶病毒基本信息
中文名：夜来香花叶病毒
学名：Telosma mosaic virus，缩写：TeMV。
分类地位：马铃薯Y病毒科（Potyviridae）、马铃薯Y病毒属（Potywirus）成员。
夜来香花叶病毒的寄主范围、病害症状、分布地区、传播途径、粒体形态、基因组等其他信息参见附录A。
5 原理
根据TeMV与抗体间的特异性反应，对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）和免疫层析试纸条检测；根据TeMV的基因组特征，对样品进行检测；通过这些方法的有效组合，判定样品是否携带TeMV。
6 仪器设备、用具及试剂
6.1 仪器设备
高速冷冻离心机、电子天平、酶标仪、PCR仪、荧光PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、-20℃低温冰箱、-80℃超低温冰箱、凝胶成像分析系统、pH计、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台等。
6.2 用具
各种量程的可调移液器（1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL、2μL）、PCR反应管、离心管（1.5mL）、研钵等。6.3 试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T 6682中相关规定。DAS-ELISA试剂按照附录B执行、免疫层析试纸条试剂按照附录C执行、RT-PCR 试剂按照附录D执行、实时荧光RT-PCR试剂按照附录E执行。
7 抽样和样品制备7.1 抽样
有病毒危害症状的植物材料单独抽样，TeMV的危害症状描述参见附录A；无危害症状的植物材料抽样方法按照SN/T2122中的规定执行。7.2 样品制备
分别按照有症状和无症状进行样品制备。有症状植株每株单独编号并采集症状部位制样：无症状植株，5株为一组编号并混合制样。称取0.5g～1.0g待测样品按1：10（质量：体积）加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，4℃下10000g离心10min，上清即为样品提取液，用于DAS-ELISA和免疫层析试纸条检测；或称取0.1 g待测样品提取核酸后用于RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测。
8 检测与鉴定
8.1 DAS-ELISA
DAS-ELISA具体方法按照附录B执行。8.2 免疫层析试纸条
免疫层析试纸条具体方法按照附录C执行。8.3 RT-PCR
RT-PCR具体方法按照附录D执行。8.4 实时荧光RT-PCR
实时荧光RT-PCR具体方法按照附录E执行。8.5 序列测定与比对
PCR产物纯化后，进行克隆、测序，或者直接测序。利用NCBI网站上的BLAST软件把测序所得到的核苷酸序列与已知的TeMV相应序列进行比对。
9 结果判定与记录
9.1 结果判定
样品检测时，检测结果判定按下述原则进行。
————若样品经DAS-ELISA或免疫层析试纸条检测结果为阴性，且RT-PCR或实时荧光RT-PCR
检测结果为阴性，则判定样品不携带TeMV。
——若样品经 DASELISA或免疫层析试纸条检测结果为阳性，且RT-PCR或实时荧光RT-PCR
检测结果为阳性，则判定样品携带TeMV，否则判定样品不携带TeMV。
————若样品RT-PCR检测结果为阳性，且实时荧光RT-PCR检测结果为阳性，则判定样品携带
TeMV，否则判定样品不携带TeMV。
————若样品RT-PCR检测结果为阳性，且序列测定结果经比对分析为TeMV，则判定样品携带
TeMV，否则判定样品不携带TeMV。9.2 结果记录
记录包括样品来源、样品种类、检测时间、检测地点、检测方法和结果、检测人员签字。DAS-ELISA 检测结果应有酶联反应数值；免疫层析试纸条检测结果应有试纸条检测图片；RT-PCR检测结果应有电泳图片；实时荧光RT-PCR检测结果应有实时荧光结果图片。
10 样品的保存
经检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在-20℃或-80℃冰箱中1年，并作好登记和标记工作，以备复验、谈判和仲裁。保存期满后，应经灭活处理。