SN ICS 65.020.20 CCS B 16
中华人民共和国出入境检验疫行业标准
SN/T 5528—2022
大麦条纹花叶病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Barley stripe mosaic virus
2022-07-07发布
2023-02-01实施
发 布
中华人民共和国海关总署
SN/T 5528—2022
大麦条纹花叶病毒检疫鉴定方法
1 范围
本文件规定了大麦条纹花叶病毒DAS-ELISA、普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR检疫鉴定方法。本文件适用于籽粒、花粉、种苗及其他植物产品中大麦条纹花叶病毒的检疫和鉴定。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 大麦条纹花叶病毒基本信息
学名：Barley stripe mosaic virus。
异名：Barley false stripe virus，Barley mild stripe virus，Barley mild stripe mosaic virus，Barley mosaic virus,Barley stripe mosaic hordeivirus,Oat stripe mosaic virus。
缩写：BSMV。
分类地位：RNA病毒域（Riboviria），正 RNA病毒界（Orthornavirae），黄病毒门（Kitrinovirico-ta），甲型超群病毒纲（Alsuviricetes），马泰利病毒目（Martellivirales），植物杆状病毒科（Virgaviri-dae），大麦病毒属（Hordeivirus）。
大麦条纹花叶病毒的其他信息参见附录A。
5 方法原理
大麦条纹花叶病毒的血清学和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据。根据BSMV与抗体之间的特异性反应，对植物样品进行双抗体夹心免疫酶联吸附测定（DAS-ELISA）；根据BSMV的基因组特征建立RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法。
6 仪器用具与试剂6.1 仪器
微量天平、高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱（4℃）、超低温冰箱、高压灭菌锅、pH计、超净工作台、酶标仪、洗板机、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析仪。6.2 用具
移液器（最大量度分别为1000μL、200μL、100μL、10μL、2.5μL）、酶联板、离心管（1.5 mL、0.2mL）、研磨用具（研钵研杵或小型料理机）。6.3 主要试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T 6682中相关规定。DAS-ELISA试剂详见附录B。RT-PCR 检测试剂详见附录C。实时荧光RT-PCR检测试剂详见附录D。
7 制备检测样品
7.1 籽粒7.1.1 直接制备
籽粒抽样按照SN/T 2122的规定执行。
根据酶联免疫测定和分子生物学检测不同的样品制备需求，随机取样或者挑选畸形、生长不成熟的籽粒直接制备检测样品。7.1.2 育苗取样
随机取样或挑选外观不正常的籽粒播撒在铺有无菌滤纸的培养盘中，培养过程中滤纸需一直保持湿润状态，或将挑选的籽粒浸泡萌芽后播种在无菌土中，培养观察。待长出完全舒展的叶片后，将表现有BSMV疑似症状的植株单独编号，未表现BSMV疑似症状的植株分组（10～20株为1组）并编号，根据需要分别用于酶联免疫测定和分子生物学检测。7.2 种苗
有症状（如叶片花叶、条斑、坏死等）的植株，每个植株进行单独编号检测。无症状植株分组并编号后进行检测，分组和检测方法参照7.1.2。7.3 其他植物产品
无症状或无法观察症状的其他植物产品，参照SN/T 2122中规定的抽样方法进行抽样，分组编号方法和检测方法参照7.1.2。
8 检测鉴定
8.1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）
将制备的样品上清液加入包被有BSMV抗体的酶联板中，进行DAS-ELISA检测，每个样品至少设置1个重复。健康的植物组织作为阴性对照，感染有BSMV的植物组织作为阳性对照，样品提取缓冲液作为空白对照，其中阴性对照的植物种类和材料（如叶片）应尽量与检测样品一致。具体操作详见附录B。