SN ICS 65.020.01 CCS B 16
中华人民共和国出入境检验疫行业标准
SN/T 5550—2022
土壤中检疫性真菌的分离、培养方法Methods for isolation,cultivation of quarantine fungi in soil
2022-07-07发布
2023-02-01实施
中华人民共和国海关总署发布
SN/T 5550—2022
土壤中检疫性真菌的分离、培养方法
1 范围
本文件明确了土壤中检疫性真菌的分离、培养方法。
本文件适用于进出境植物及其产品、集装箱携带的土壤和田间疫情监测的土壤中检疫性真菌的分离、培养。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注明日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
SN/T 1102 出入境集装箱检验检疫规程SN/T 1131 大豆疫霉病菌检疫鉴定方法SN/T 1158 进出境植物盆景检疫规程SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
土壤 soil
在地球表面生物、气候、母质、地形、时间等因素综合作用下所形成的能够生长绿色植物，具有生态环境调控功能、处于永恒变化中的疏松矿物质与有机质的混合物。3.2
土壤悬浮液 soil suspension
将样品土壤与定量的无菌水混合，反复振荡后得到的混合液。3.3
稀释倒平板法 pour plate method
将待分离的土壤用无菌水作一系列的稀释，分别取不同稀释液少许至灭菌的培养皿中，再往培养皿中倒入已溶化并冷却至 45℃左右的琼脂培养基，混匀，待琼脂凝固后，进行保温培养的方法。3.4
选择性培养基 selective medium
进行植物病原菌分离培养时，为促进目标菌落的形成，抑制其他非目标菌的生长，在培养基中添加不同的碳源、氮源或抑制性物质而形成的具有一定选择能力的培养基。
4 仪器设备和主要试剂4.1 仪器设备
超净工作台、高压灭菌器、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、恒温水浴锅、体视显微镜、生物显微镜（带显微照相装置）、天平（感量0.1g）、测微尺、微量移液器及枪头、光照培养箱等。4.2 主要试剂和培养基4.2.1 试剂
玉米粉、马铃薯、葡萄糖、琼脂粉、Difco玉米粉琼脂、氯霉素、新霉素、链霉素、氯四环素、金霉素、氨苄青霉素钠盐、匹马霉素、硫酸链霉素、万古霉素、利福平、利福平钠盐、苯菌灵、恶霉灵、五氯硝基苯、蛋白胨、牛胆汁、磷酸二氢钾（KHPO）、磷酸氢二钾（KHPO）、七水硫酸镁（MgSO7HO）、硫酸镁（无水）、多半乳糖醛酸、孟加拉红、麦芽膏粉、松膏、蛋白胨、酵母膏、V8蔬菜汁、番茄汁、胡萝卜、黑麦、牛肉膏、碳酸钙、B-谷甾醇、色氨酸、氯化钙、硫氨、氯化钾、乙二胺四乙酸铁钠、L-天门冬酰胺、L-山梨糖、牛胆盐、四硼酸钠。除另有规定外，所有试剂均为分析纯。4.2.2 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、孟加拉红琼脂培养基、麦芽汁琼脂培养基（MEA）、玉米粉琼脂培养基（CMA）、松膏培养基、马丁氏培养基、V8培养基、番茄汁培养基、胡萝卜丝培养基（CPA）、黑麦番茄汁琼脂培养基、加抗菌素黑麦番茄汁琼脂培养基、镰孢属选择性培养基、轮枝孢菌属选择性培养基、疫霉属选择性培养基、卵孢子培养基（参见附录A）。
5 取样及接收样品5.1 取样
根据文件SN/T 1102、SN/T 1131、SN/T 1158和SN/T 2122针对性地对土壤进行检查和取样。在田间进行疫情监测时，采用五点取样法采集土壤样品，每一取样点除去地面的枯枝落叶等杂物，铲去地表1cm～2cm的土层，挖10cm×10cm×15cm土壤，混合后取500g，晾干后粉碎，过100目筛。填写相关记录单（如：采样时间、地点、数量、采样人等信息）。5.2 样品传递
土壤样品放在耐受性好、密闭、防渗漏的样品袋中。在样品袋外部要贴有标签（样品编号、货物名称、取样部门、取样时间等信息），低温（4℃～10℃）保存和运输样品，防止可能含有的有害生物逃逸、扩散，确保样品真实、安全、及时传递到实验室。随检样品应附有送检单，送检单应与样品分开放置。对运输样品的运输工具需要进行消毒处理。5.3 样品接收
核对样品与送检单，检查包装容器及样品的破损情况，有无污染，对不符合要求的应重新取样，填写样品接收单。待检土壤置于4℃冰箱保存，在1个月内分离完样品。
6 土壤中检疫性真菌分离方法
6.1 土壤中检疫性真菌的种类
土壤中检疫性真菌的种类较多，主要包括腐霉菌属、腥黑粉菌属、疫霉菌属、镰孢属、轮枝孢菌属、丝核菌属等真菌（参见附录B）。