ICS11. 040. 01 CCSC30
中华人民共和国医药行业标准
YY/T0870.
8—2024
医疗器械遗传毒性试验 第8部分:体内
哺乳动物肝细胞程序外 DNA合成试验
Testforgenotoxicityofmedicaldevices—
Part8:UnscheduledDNAsynthesistestwithmammalianlivercellsinvivo
2024-07-08发布
2025-07-20实施
国家药品监督管理局 发 布
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前 言
本文件按照 GB/T1. 1—2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件是 YY/T0870《医疗器械遗传毒性试验》的第8部分。YY/T0870已经发布了以下部分: ———第1部分:细菌回复突变试验; ———第2部分:体外哺乳动物细胞染色体畸变试验; ———第3部分:用小鼠淋巴瘤细胞进行的 TK 基因突变试验; ———第4部分:哺乳动物骨髓红细胞微核试验; ———第5部分:哺乳动物骨髓染色体畸变试验; ———第6部分:体外哺乳动物细胞微核试验; ———第7部分:哺乳动物体内碱性慧星试验; ———第8部分:体内哺乳动物肝细胞程序外 DNA 合成试验。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由国家药品监督管理局提出。 本文件由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会(SAC/TC248)归口。 本文件起草单位:山东省医疗器械和药品包装检验研究院、上海交通大学医学院附属第九人民医 院、北京市医疗器械检验研究院(北京市医用生物防护装备检验研究中心)。 本文件主要起草人:王鸾鸾、刘昕、宋伟、孙皎、张奥、褚祥宇、车国喜。
Ⅰ
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引 言
GB/T16886. 3中给出的检测潜在遗传毒性物质的试验方法,未给出详细的试验步骤,因此不适宜 直接用于 医 疗 器 械 的 检 测。YY/T 0870 根 据 医 疗 器 械 的 特 性 给 出 了 详 细 的 试 验 步 骤,可 作 为 GB/T16886. 3 中遗传毒性试验的补充方法标准。 本文件提供了一种评价医疗器械产生的哺乳动物体内遗传毒性效应的方法,以确定医疗器械可能 产生的 DNA 损伤及修复情况。 YY/T0870旨在建立医疗器械遗传毒性的具体试验方法,拟由8个部分构成。 ———第1部分:细菌回复突变试验。目的在于给出医疗器械/材料细菌回复突变试验的详细试验 方法。 ———第2部分:体外哺乳动物细胞染色体畸变试验。目的在于给出医疗器械/材料体外哺乳动物细 胞染色体畸变试验的详细试验方法。 ———第3部分:用小鼠淋巴瘤细胞进行的 TK 基因突变试验。目的在于给出医疗器械/材料用小鼠 淋巴瘤细胞进行的 TK 基因突变试验的详细试验方法。 ———第4部分:哺乳动物骨髓红细胞微核试验。目的在于给出医疗器械/材料哺乳动物骨髓红细胞 微核试验的详细试验方法。 ———第5部分:哺乳动物骨髓染色体畸变试验。目的在于给出医疗器械/材料哺乳动物骨髓染色体 畸变试验的详细试验方法。 ———第6部分:体外哺乳动物细胞微核试验。目的在于给出医疗器械/材料体外哺乳动物细胞微核 试验的详细试验方法。 ———第7部分:哺乳动物体内碱性彗星试验。目的在于给出医疗器械/材料哺乳动物体内碱性彗星 试验的详细试验方法。 ———第8部分:体内哺乳动物肝细胞程序外 DNA 合成试验。目的在于给出医疗器械体内哺乳动 物肝细胞程序外 DNA 合成试验的详细试验方法。
Ⅱ
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医疗器械遗传毒性试验 第8部分:体内
哺乳动物肝细胞程序外 DNA合成试验
1 范围
本文件描述了医疗器械体内哺乳动物肝细胞程序外 DNA 合成试验方法。
本文件适用于通过测定医疗器械引起的哺乳动物肝细胞程序外 DNA 损伤,评价医疗器械是否具
有潜在遗传毒性作用。
注:纳米材料的体内哺乳动物肝细胞程序外 DNA 合成试验可能需要对本文件中的方法进行特定的修订,但本文件
未给予描述。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB14925 实验动物 环境及设施 GB/T16886. 2 医疗器械生物学评价 第2部分:动物福利要求 GB/T16886. 3 医疗器械生物学评价 第3部分:遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验 GB/T16886. 12 医疗器械生物学评价 第12部分:样品制备与参照材料
3 术语和定义
3. 1 GB/T16886. 3和 GB/T16886. 12界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 程序外 DNA合成 unscheduledDNAsynthesis;UDS 发生在细胞周期的S期半保留 DNA 程序合成之外的 DNA 合成。
4 试验原理
体内哺乳动物肝细胞 UDS试验是利用哺乳动物进行的体内体细胞遗传毒理学试验,其测定取决于
DNA 损伤部位切除和取代的碱基的数量。相较于“短程修复”(1对~3对碱基),UDS试验对“长程修
复”(20 对 ~30 对碱基)具有较高的敏感性。UDS 试验可检测整个基因组且敏感性较高,因此对于
DNA 损伤未修复、错配修复或错复制导致的突变而无法充分如实反映其 DNA 修复过程的情况,可能
有所补偿。
UDS试验的遗传学终点为肝细胞发生的 DNA 损伤及其后的修复。将新分离的哺乳动物肝细胞置
于含有5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)的培养基中培养一段时间,如果受试物造成细胞 DNA 损伤,可引
起细胞的自主性 DNA 修复。在修复过程中 EdU 整合到 DNA 链中,在 Cu
+ 的作用下与含有荧光探针
标记的叠氮化合物发生点击反应(即一价铜催化的叠氮基与端基炔发生的共价反应),新合成的 DNA
被荧光探针所标记。通过荧光强度观察 EdU 的掺入量,评价医疗器械潜在的致突变性。
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5 主要设备
CO2 培养箱、荧光显微镜等。
6 试剂
Ⅰ型胶原蛋白酶(0. 03%)、Hank’s平衡盐溶液、磷酸盐缓冲液(不含 Ca 2+ 、Mg 2+ )、细胞培养液、台 盼蓝、固定液(如4%的多聚甲醛)、洗涤液(如含3% 牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液)、通透液[如含 0. 3%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)的磷酸缓冲盐溶液]、市售的 EdU 细胞增殖检测试剂盒。 注:推荐使用市售的固定液、洗涤液、通透液试剂盒。
7 实验动物
7. 1 总体要求 所有的动物试验均应在经国家认可机构认可的实验室内进行,并应遵守与实验动物福利有关的全 部适用法规,以符合 GB/T16886. 2的要求。这些研究应在良好实验室质量管理规范或其他经批准的 质量保证体系的控制下进行。 7. 2 动物选择
选用SPF级健康初成年啮齿类动物,推荐使用大鼠(6周龄~12周龄)。每组至少3只可供分析的
动物。如已有充分的对照数据库,则同时进行的阴性对照组和阳性对照组可用1只或2只动物。试验
开始时,动物体重差异应不超过同种性别平均体重的±20%。选用常规饲料,饮水不限制。如果受试物
掺入饲料进行染毒,应选择适当的饲料以保证受试物充分混 合,动物 可单独饲养或同性别分小组笼
养,实验动物饲养条件应符合 GB14925的有关规定。
注:如在进行本试验时,已有资料表明同一品系、相同的暴露途径,在不同性别之间遗传毒性无差别,则用单一性别
(优先用雄性)动物即可。
8 样品制备
宜根据 GB/T16886.
12的原则制备试验液。宜使用适宜的极性和/或非极性溶剂作为浸提介质。
若使用未经充分确认的浸提介质,应提供相应的数据支持资料来表明它们与试验样品和试验系统之间
的相容性并排除浸提介质自身的遗传毒性。
当最高浓度的试验液(即试验样品原液或100%的浸提原液)试验结果为阴性时,可考虑单剂量组
试验。采用其他多剂量试验或剂量反应试验时,宜对试验所采用的剂量范围提供相应的支持性数据。
9 对照样品制备
9.
1 阴性对照
阴性对照选用不加试验样品的同批号浸提介质,在相同条件下制备。
9. 2 阳性对照
2 应选择适宜的阳性对照剂量以得到阳性结果,阳性对照物举例见表1。阳性对照与实验动物的接
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触途径可不同于试验样品与实验动物的接触途径。如有充分理由时也可采用其他适宜的阳性对照物。
表 1 阳性对照物举例
采样时间 化学物 化学物质登记号
早期采样2h~4h N-二甲基亚硝胺 62-75-9
晚期采样12h~16h 2-乙酰氨基芴 53-96-3
注:N-二甲基亚硝胺推荐蒸馏水稀释,接触浓度为280mg/kg;2-乙酰氨基芴推荐溶解介质为聚乙二醇400,接触 浓度为50mg/kg。
9.
3 未处理对照
如不能证实所用浸提介质不具有致突变性,还需设未处理对照。
10 试验步骤
10.
1 预试验
如怀疑试验样品可能对实验动物产生毒性时,应进行预试验。宜设置3个剂量水平(较低剂量一般
应为高剂量的50%~25%),覆盖从最大到小或无毒性的剂量范围。高剂量组应是产生明显毒性的剂
量,高于该剂量即有可能引起动物死亡。
10. 2 实验动物处理 根据试验样品预期的人体接触途径设计合适的接触途径以确保与靶器官充分接触,如静脉注射、腹 腔注射、皮下注射等。通常采用单次接触,宜根据实验动物的体重来确定样品接触最大单剂量体积。样 品接触最大单剂量体积的选择见 GB/T16886. 11—2021中表 B. 1。 10. 3 肝细胞制备
通常接触动物后2h~4h(即早期采样)和12h~16h(即晚期采样)制备肝细胞。如在接触后的任
一时期得到的试验结果为阳性,则不必进行另一时期的后续步骤。根据已有的毒代动力学资料也可采
用其他采样时间。
采用胶原蛋白酶灌注法分离肝细胞后,推荐采用台盼蓝染色计数测定阴性对照组肝细胞存活率,结
果应大于50%。
10. 4 程序外 DNA合成的测定 宜根据下列操作步骤进行检测: a) 新鲜分离的肝细胞(推荐细胞浓度为1×10 6 个/mL)放入含有盖玻片的培养皿或黑色细胞培 养板中,在含有 EdU 的培养液中进行短期孵育(通常不超过细胞周期的10%左右的时间,推 荐2h); b) 弃去培养皿中的培养液,并加入固定液在室温下进行固定; c) 弃去固定液,用洗涤液洗涤细胞; d) 弃去洗涤液,加入通透液在室温孵育细胞; e) 弃去通透液,加入洗涤液洗涤细胞。弃去洗涤液,加入反应液(含荧光探针等标记的叠氮化物 的溶液)避光孵育细胞; 3
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f) 弃去反应液,用洗涤液洗涤细胞。弃去洗涤液,加入与细胞 核结合的染色剂对细胞进行核
染色;
g) 弃去染色液,用洗涤液洗涤细胞;
h) 通过荧光显微镜对细胞进行观察拍照。
注:具体的操作步骤见所购试剂盒的操作说明书。
10.
5 结果观察
最终每只动物至少从2个标本中选择100个形态正常(细胞形状完整等)的细胞,通过荧光显微镜
观察各细胞的荧光强度以进行 UDS评价。如单只动物细胞计数少于100个,应说明理由。
11 数据处理与结果评价
11. 1 数据处理 采用适宜的图像软件测定用反应液标记的细胞核的平均荧光强度,扣除细胞背景值(即细胞质荧光 强度),得到此细胞的净平均荧光强度。净平均荧光强度用于评价细胞程序外 DNA 的损伤。 采用适当的统计学方法进行分析,以评价试验样品对 DNA 的损伤作用。 11. 2 结果评价与解释 评价阳性和阴性反应的标准如下: a) 阳性反应:与阴性对照组相比,净平均荧光强度有统计学意义的显著增加或超过历史阴性对照 数据范围且有明显的剂量———反应关系(若有剂量组); b) 阴性反应:与阴性对照组相比,净平均荧光强度无统计学意义的显著增加或结果在历史阴性对 照数据范围内且无明显的剂量———反应关系(若有剂量组)。 阳性反应表明在本试验体系中试验样品试验液能诱导哺乳动物肝细胞 DNA 的损伤;阴性反应表 明在本试验体系中试验样品试验液不能诱导哺乳动物肝细胞 DNA 的损伤。在少数情况下,所得到的 资料不能判断试验样品是否诱导哺乳动物肝细胞程序外 DNA 损伤时,可使用优化试验条件(例如,剂 量间隔、其他给药途径、其他采样时间等)进行重复试验或者对额外的肝细胞进行评价以建立生物学相 关性。
12 试验报告
试验报告中宜包含下列信息。
a) 试验样品:来源、批号、有效日期(适用时)。
b) 介质。
c) 实验动物:
———实验动物的种属、品系、级别、数量、体重、性别、来源;
———实验动物饲养环境;
———实验动物设施使用许可证号。
d) 试验条件:
———剂量和组别;
———接触途径、试验周期、观察指标;
———肝细胞制备和培养方法;
———培养温度和时间;
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———阳性和阴性对照物的最终浓度;
———分析细胞的数目。
e) 结果:
———阴性(溶剂/介质)和阳性对照资料(浓度/剂量和溶剂);
———统计学分析;
———结果的讨论。
f) 结论。
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参 考 文 献
[1] GB/T16886. 11—2021 医疗器械生物学评价 第11部分:全身毒性试验 [2] OECD486(1997) 体内哺乳动物肝细胞程序外 DNA 合成试验 [3] AgnieszkaPierzynska-Mach,M.(2012),Subnuclearlocalization,ratesandeffectivenessof UVC-inducedunscheduledDNAsynthesisvisualizedbyfluorescencewidefield,confocalandsuper-res- olutionmicroscopy,Vol. 15,NO. 8,1156-1167.
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