ICS 07.080 G 04
GB
中华人民共和国国家标准
GB/T309872014
植物中游离氨基酸的测定
Determination of free amino acids in plants
2015-03-01实施
2014-07-24发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
中国国家标准化管理委员会 发布 GB/T 30987—2014
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中国测试技术研究院提出。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387)归口。 本标准负责起草单位：中国测试技术研究院、中测测试科技有限公司、四川中测生物科技有限公司。 本标准主要起草人：谭和平、徐文平、赵爱平、孙登峰、谭福元。
- GB/T30987—2014
植物中游离氨基酸的测定
1范围
本标准规定了植物中游离氨基酸的测定方法，包括全自动氨基酸分析仪法（第一法）和高效液相色谱仪法（第二法)两种方法。
本标准适用于茶叶、中药材、烟叶等植物样品中的游离氨基酸的测定。 注：本标准检测的氨基酸种类参见附录A。
2规范性引用文件
2
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T8303茶磨碎试样的制备及其干物质含量测定
3术语与定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
游离氨基酸 freeaminoacids 植物材料中未与其他化学物质结合，以单个分子或离子形式存在，可被水溶液或其他溶剂直接浸提
出来的氨基酸。
43 全自动氨基酸分析仪法（第一法）
4.1原理
样品中游离氨基酸经沸水提取后，经氨基酸分析仪的磺酸型阳离子交换柱分离后，在135℃下加热氨基酸与三酮混合反应，伯胺与三酮生成蓝紫色化合物，仲胺与三酮生成黄色化合物，分别在 570nm和440nm波长下检测两种衍生产物，保留时间定性，外标法定量。 4.2试剂和材料 4.2.1试剂
氨基酸标准品（纯度>98%)种类参见附录A；柠檬酸锂（四水）、氯化锂、柠檬酸、氢氧化锂、硼氢化钠、无水乙酸钠、三酮、无水乙醇、硫代双乙醇、聚氧乙烯月桂醚、辛酸、苯甲醇、乙二醇甲醚和冰乙酸均为优级纯；氮气为高纯氮（纯度≥99.999%）。
除特别要求以外，本标准所使用的实验用水均为一级超纯水，具体要求见GB/T6682。
1 GB/T30987—2014
4.2.2材料
快速定量滤纸；0.45μm水相滤膜和0.45μm有机相滤膜。 4.3标准溶液配制 4.3.1混合氨基酸标准储备液配制
称取各氨基酸对照品适量，用纯水溶解，配制成混合溶液。混合标准溶液中的茶氨酸和其他20种氨基酸的浓度分别为5.00μmol/mL和1.25μmol/mL。储备溶液冷冻保存有效期为1个月。 4.3.2混合氨基酸标准工作液配制
准确吸取2000μL氨基酸混合母液（见4.3.1)至5mL容量瓶中，用纯水稀释定容至刻度，摇匀，即得到第一份标准溶液。将第一份标准溶液逐级稀释2倍，制成总共7个不同浓度的梯度标准溶液。 7个浓度标准溶液的混合标样中茶氨酸及其他20种氨基酸的浓度分别为：2000.00nmol/mL和 500.00nmol/mL，1000.00nmol/mL和250.00nmol/mL，500.00nmol/mL和125.00nmol/mL， 250.00nmol/mL和62.50nmol/mL，125.00nmol/mL和31.25nmol/mL，62.50nmol/mL和 15.63nmol/mL，31.25nmol/mL和7.81nmol/mL。氨基酸标准工作溶液现配现用。 4.4流动相配制 4.4.1流动相B,(pH2.8)配制
准确称取柠檬酸锂（四水）5.73g，氯化锂1.24g，柠檬酸19.90g，溶于700mL纯水中，加人 30.0mL无水乙醇，5.0mL硫代双乙醇，4.0mL聚氧乙烯月桂醚，再加人0.1mL辛酸，转移至1000mL容量瓶中，用纯水定容，过0.45μm水相滤膜备用。 4.4.2流动相B2(pH3.7)配制
准确称取柠檬酸锂（四水）9.80g，氯化锂6.36g，柠檬酸12.00g，溶于700mL水中，加人30.0mL 无水乙醇，5.0mL硫代双乙醇，4.0mL聚氧乙烯月桂醚，再加人0.1mL辛酸，转移至1000mL容量瓶中，用纯水定容，过0.45μm水相滤膜备用。 4.4.3流动相Bs(pH3.6)配制
准确称取柠檬酸锂（四水）8.79g，氯化锂26.62g，柠檬酸11.27g，溶于700mL水中，加人100mL 无水乙醇，3.0mL苯甲醇，4.0mL聚氧乙烯月桂醚，再加人0.1mL辛酸，转移至1000mL容量瓶中，用纯水定容，过0.45μm水相滤膜备用。 4.4.4流动相B(pH4.1)配制
准确称取柠檬酸锂（四水）9.80g，氯化锂38.15g，柠檬酸3.30g，溶于700mL水中，加人4.0mL聚氧乙烯月桂醚，再加人0.1mL辛酸，转移至1000mL容量瓶中，用纯水定容，过0.45μm水相滤膜备用。 4.4.5流动相Bs配制
流动相Bs为经0.45μm水相滤膜过滤后的一级超纯水。
2 GB/T30987—2014
4.4.6流动相B。配制
准确称取氢氧化锂8.40g，溶于700mL水中，加人30.0mL无水乙醇，4.0mL聚氧乙烯月桂醚，再加人0.1mL辛酸，转移至1000mL容量瓶中，用超纯水定容，过0.45μm水相滤膜备用。
4.5柱后衍生化反应溶液配制 4.5.1反应溶液R，配制
准确称取三酮39.0g，溶于979mL乙二醇甲醚中，超声溶解5min，过0.45μm有机相滤膜，加人硼氢化钠81.0mg，氮气鼓泡30min，放置过夜使用。
注：反应溶液R制备好后宜尽快使用完毕，不宜长期储存。
4.5.2反应溶液R2配制
准确称取无水乙酸钠204.0g，加人300mL水，123mL冰乙酸，401mL乙二醇甲醚，超声至溶解，转移至1000mL容量瓶中，用水定容，过0.45μm有机相滤膜，氮气鼓泡10min，备用。 4.5.3反应溶液R配制
准确移取无水乙醇50mL于1000mL溶量瓶中，用纯水定容至1000mL，摇匀后利用0.45μm有机相滤膜过滤，备用。 4.6主要仪器设备
分析天平：感量0.00001g。 移液器：量程分别为10μL～100μL，20μL～100μL及200μ～1000μL。 氨基酸自动分析仪：配备双通道可见光检测器，配备六元梯度分离系统，配备三元反应液输送
系统。
分离色谱柱：磺酸型阳离子交换柱（参考型号：日立生理体液分析柱PF，3μm，4.6mm×60mm）。 4.7分析步骤 4.7.1样品制备
样品依据GB/T8303要求制样，过40目筛。准确称取磨碎试样2.0g（精确到0.0001g）样品，置于250mL锥形瓶中，加人200mL煮沸的水冲泡，95℃水浴加热，每隔5min摇匀一次，提取10min后取出，利用布氏漏斗和滤纸趁热抽滤，滤液冷却至室温后，用纯水定容至250mL，摇匀后取适量样品溶液，经0.45μm滤膜过滤后待测。
4.7.2仪器分离体系运行条件
流动相配制见4.4，流动相流速为0.35mL/min，流动相及温度梯度条件见表1。表1条件适用于日立L-8900氨基酸自动分析仪及其生理体液分析柱（PF4.6mm×60mm），使用其他品牌或型号的氨基酸自动分析仪及分离柱，可根据不同仪器及色谱柱作适当调整。仪器进样体积为20μL。
3 GB/T30987—2014
表 1 氨基酸分析仪分离梯度条件程序
B, / % 100 100 100 80 70 10 10 10 o o 0 o 0 60 60 o 0 0 0 0 0 0 0 0 100 100
B / % o 0 0 o 0 o o 0
时间/min 0.0 2.0 21.5 21.6 32.5 32.6 36.5 43.5 43.6 50.5 50.6 68.4 69.5 69.6 74.0 74.1 82.0 82.1 92.5 99.5 99.6 112.5 112.6 121.5 121.6 148.0
Bz / % 0 0 0 20 30 90 90 90 100 100 0 0 0 0 o 0 0 20 20 20 0 0 0 0 0 0
B / % 0 0 0 o 0 o 0 0 0 0 0 0 0 40 40 100 100 80 80 80 100 100 0 0 0 0
Bs / % 0 0 o 0 o 0 0 0 0 o 0
Bs / % 0 0 0 0 o 0 0 0 0 o 0 0 0 0 0 0 0 0 0 o 0 o 100 100 0 0
柱温/℃ 38 30
60
40
0 100 100 100 0 0 0 0 o 0 o o o 0 0 o 0
70
45
0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0
70
38
4.7.3 反应检测体系运行条件
反应液配制见4.5，反应柱温度为135℃，反应液流速为0.30mL/min，反应液梯度条件见表2。检测器检测波长570nm和440nm。
4 GB/T30987—2014
表2氨基酸分析仪反应体系条件程序 R / %
R2 / % 50 50 0 0 50 50
Rs/% 0 0 100 100 0 0
时间/min
0.0 116.0 116.1 126.0 126.1 148.0
50 50 0 0 50 50
4.7.4 绘制校正曲线
启动氨基酸自动分析仪，设定工作参数，待基线稳定后，分别吸取不同梯度浓度的混合氨基酸标准工作溶液（见4.3），注人氨基酸自动分析仪进行测定，分别得到21种氨基酸的峰面积。分别以各氨基酸峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，建立校正曲线。通过保留时间识别各氨基酸出峰顺序。混合氨基酸标准工作液色谱图见图1。
mV
3A
usv
od

50
VA-S M 0 0 5 0
40 -
dsv AS AS 00 T
sA7 Obe
0 3
6
30
Siy 07 'O1T
D8
'9f
0 I
186 3
20
62*69 3
1
10-
L8R'1
006
八
110 min
100
20
30
40
50
60
70
80
90
10
图1 混合氨基酸标准工作液图谱（氨基酸分析仪法）
4.7.5样品测定
用氨基酸分析仪测定样品溶液，分别得到样品中各氨基酸色谱峰面积，代入校正曲线计算含量。以超纯水作为空白样品，在相同测定条件下进行测定，计算空白样品中各氨基酸本底值。样品测定值扣除空白样品中各氨基酸本底值，即得各样品中氨基酸净含量。
5 GB/T 30987-2014
4.8 结果计算与表示
按式(1)计算样品中各游离氨基酸的含量。
(c-ck)×V×M×10-6
W,=
X100%
..（1)
mXml
式中： W, 试样中各氨基酸组分的含量，单位为毫克每100克（mg/100g）；
试样溶液中由校正曲线计算出的氨基酸浓度，单位为纳摩尔每毫升（nmol/mL）；空白试样溶液中由校正曲线计算出的氨基酸浓度，单位为纳摩尔每毫升（nmol/mL）；试样总体积，单位为毫升（mL）；
c
Ck
-
V M 氨基酸的摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol)； m - 试样质量，单位为克（g）； m 试样干物率，测定方法见GB/T8303。 以两次测定的算术平均值作为测定结果，结果精确至0.01mg/100g。
4.9 9精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的12%。
4.10方法检出限
方法检出限参见附录A中表A.1。
5高效液相色谱仪（HPLC)法（第二法）
5
5.1原理
样品中游离氨基酸经6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（AQC)衍生，使之生成具有荧光的衍生物，经液相色谱分离，用荧光检测器测定，保留时间定性，外标法定量。
5.2 2试剂和材料
5.2.1试剂
氨基酸标准品种类与纯度与4.2.1要求相同。6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（纯度>98%， 6-Aminoquinolyl-n-hydroxysuccinimidylCarbamate，AQC）；无水硼砂，磷酸氢二钠（NazHPO4），磷酸二氢钾（KH2PO,），盐酸三乙胺和磷酸均为优级纯试剂；乙腈（色谱纯）。
实验用水与4.2.1要求相同。 5.2.2材料
快速定量滤纸；0.45μm水相和0.45μm有机相滤膜。 5.3 混合氨基酸标准工作溶液配制
同4.3.2。
6