GB/T 27765—2011
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国纳米技术标准化技术委员会（SAC/TC279)提出并归口。 本标准负责起草单位：中国人民解放军第二军医大学、复旦大学及地科院矿产资源研究所。 本标准主要起草人：杨勇翼、俞彰、周健雄、张天宝。
H GB/T27765-2011
SiO2、TiO2、Fe304及Al203纳米颗粒生物效应的透射电子显微镜检测方法
1范围
本标准规定了透射电子显微镜检测含有SiO2、TiO2、Fe:O.及Al2O：纳米颗粒材料的生物试样的技术和规范。
本标准适用于SiO2、TiO2、FesO，及Al2O3纳米颗粒材料的生物效应透射电镜检测的生物薄试样超微结构分析。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T18873—2008生物薄试样的透射电子显微镜-X射线能谱定量分析通则 GB/T19619-2004纳米材料术语 ISO/IEC17025：2005检测和校准实验室认可准则（Generalrequirementsforthecompetenceof
testingandcalibrationlaboratories)
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3. 1
纳米颗粒nanoparticles 纳米尺度的固体粒子。本标准中出现的纳米颗粒材料特指为SiO2、TiO2、Fe:O4及Al2O，纳米颗
粒材料。 3. 2
生物效应biologicaleffect 纳米材料与生命过程的相互作用产生的生理功能、生化功能及形态结构的变化。
3. 3
生物效应检测biologicaltest 采用生物学、化学、毒理学与医学等领域的实验技术进行检验测量。
3. 4
生物薄试样thinbiologicalsample 生物薄试样是指采用超薄切片机切成的、厚度为40nm～100nm的生物试样，用于透射电镜观察。
4基本原理
纳米颗粒材料的表面理化特性使其易形成团聚，经分散后与生物体接触。纳米颗粒材料与生物体接触后，需采用超微结构制样方法，将其制成生物薄试样，在透射电镜下检测纳米颗粒材料作用于生物
1 GB/T27765--2011
体后产生的细胞及细胞器的超微结构变化，以确定纳米颗粒材料对生物体的生物效应作用。用案焦的高能电子束照射生物薄试样的微小区域，人射的电子束大部分透过薄试样，形成透射电子，透射电子中含有大量携带有生物薄试样内部信息的非弹性散射电子，非弹性散射电子在荧光屏、照相底片或CCD 上成像，形成生物薄试样的超微结构图像。
5仪器设备和材料
5.1 仪器设备 5.1.1 透射电子显微镜。 5.1.2 超薄切片机。 5.1.3 制刀机。 5. 1. 4 玻璃刀或钻石刀。 5.1.5 恒温烘箱（30℃~70℃）。 5.1.6 超声波清洗仪。 5.2材料 5.2.1 戊二醛。 5.2.2 四氧化钱。 5.2.3 乙醇。 5.2.4 丙酮。 5.2.5 环氧树脂。 5.2.6 醋酸双氧铀。 5.2.7 枸橡酸铅。
6 仪器的环境条件
超薄切片机、透射电子显微镜的工作环境应符合以下要求： 6.1超薄切片机 6.1.1切片室应为超薄切片专用房间。 6.1.2相对湿度小于60%。 6.1.3温度：(20±5)℃。 6.1.4电源电压：220(1士10%)V。 6.2透射电子显微镜 6.2.1 电镜室应为电镜专用房间。 6.2.2相对湿度小于60%。 6.2.3温度：(20±5)℃。 6.2.4 杂散电磁场于扰应小于0.1μT。 6.2.5 电源电压及频率应稳定[220(1±10%)V，50Hz士1Hz]。 6.2.6具备仪器专用地线，接地电阻应小于100Q。
"
2 GB/T27765—2011
7纳米颗粒材料分散
7.1将纳米颗粒材料与溶剂按一定的比例充分混和。 7.2放人超声波清洗仪中分散。
注：建议分的条件：水温（25～30)℃；功率300W；频率40(1士10%）kHz；时间30min左右。
8生物薄试样制备
8.1纳米颗粒材料 8.1.1将不同浓度、已分散的纳米颗粒悬液滴在有支持膜（一般用火棉胶或Fomvar膜）的$3mm透射电镜专用载网上。 8.1.2将滴有纳米颗粒材料悬液的电镜专用载网放人恒温烘箱中，60℃烘烤2h。 8.2生物组织 8.2.1取材：将生物组织在(2～3)%戊二醛固定液（4℃)中迅速切成小于1mm的小块。配制戊二醛固定液可参考附录C。 8.2.2前固定：将小块组织浸泡在20倍体积、4℃的（2～3）%戊二醛固定液中固定（1～4)h，用缓冲液充分漂洗。 8.2.3后固定：将生物小块组织浸泡在1%钱酸，4℃固定2h。配制钱酸可参考附录D。 8.2.4脱水：用乙醇或丙酮梯度脱水。建议乙醇或丙酮梯度脱水的顺序为：30%、50%、70%、90%乙醇各一次；90%丙酮1次，100%丙酮3次，每次（10~15）min。 8.2.5包埋：在按比例配制好的环氧树脂（以Epon812为例，配制比例可参考附录B)中浸透后，在胶囊 (或硅胶包埋板）内进行包埋。建议浸透比例为，丙酮：包埋剂（漫透时间）：1：1[(1～2)h]；1：2(12h)；纯包埋剂(1h）。 8.2.6聚合：在恒温烘箱内进行聚合，37℃聚合12h后，升温至60℃聚合（36～48)h。 8.2.7修块：包埋块在进行超薄切片之前，将分析部位修成易于超薄切片的形状。 8.2.8超薄切片：采用超薄切片机将已修好的包埋块切成超薄切片，厚度般要求在（40～100)nm。 8.2.9染色：采用醋酸铀和枸橡酸铅对超薄切片进行双重金属染色后待检。 8.3培养细胞 8.3.1 前固定：用橡皮刮将细胞从培养血底部刮下或胰酶消化下来，低速离心（800g，5min）成小团块，弃上清，沿管壁加人（2～3)%戊二醛固定液，放人4℃冰箱固定（1～4)h。用缓冲液充分漂洗。 8.3.2后固定：经戊二醛固定的细胞团块用缓冲液轻轻漂洗后，加人1%钱酸，放入4℃冰箱固定1h。 8.3.3脱水(同8.2.4)。 8.3.4 包埋（同8.2.5）。 8.3.5合(同8.2.6)。 8.3.6 修块（同8.2.7)。 8.3.7 超薄切片（同8.2.8）。 8.3.8染色（同8.2.9)。
3 GB/T27765—2011
9透射电子显微镜准备工作
9.1开机，抽真空至电镜正常工作所需的高真空后再稳定30min以上。 9.2选择测试生物薄试样所需的加速电压，建议检测生物薄试样所需的加速电压选择在60kV~ 120kV之简。 9.3调节电子枪的灯丝电流，使束流处于稳定饱和状态。 9.4对电子光学系统进行对中调整，尽可能消除电子束的像散，使透射电子显微镜处于最佳工作状态。
10 测置分析步骤
10.1纳米颗粒材料 10.1.1将干燥的纳米颗粒薄试样放人透射电镜。 10.1.2在低倍（3000倍～4000倍）下寻找合适的试样部位，要求被分析试样无破损、无污染。 10.1.3在高倍（40000倍～50000倍）时观察纳米材料的分散情况，测量纳米颗粒的粒径并记录实验结果。 10.2生物薄试样 10.2.1在低倍（小于4000倍）下寻找合适的生物薄试样部位，要求被分析试样无破损、无污染、无震颤条纹。 10.2.2将确定的试样分析部位置于电子显微镜的观察中心。 10.2.3逐步增加放大倍数（一般放大倍数在10000～30000即可，少数需放大30000倍以上），寻找细胞内外、细胞器内外有无纳米材料。 10.2.4仔细分析纳米材料分布的位置，注意区分样品制备过程中引人的污染物和纳米颗粒材料。如果无法判别，建议采用X射线能谱分析对颗粒物进行定性分析，分析方法参见GB/T18873-~2008。 10.2.5精确聚焦并存储实验结果。
11分析结果的发布
分析结果报告应包括以下信息（参见附录A），亦可参照ISO/IEC17025：2005中有关分析报告格式。 11.1分析报告的惟一编号。 11.2送样人姓名，单位和地址。 11.3样品的接收日期。 11.4分析仪器及其工作条件。 11.5分析结果和必要的说明。 11.6分析报告负责人的签字。 11.7分析报告的页码。 11.8实验室名称和地址。 11.9分析报告的日期。
4 GB/T27765-—2011
附录A (资料性附录）
SiO2、TiO2、Fe;04及Al,O;纳米颗粒生物效应的透射电子显微镜分析结果报告
报告编号：送样单位：送样日期：样品内容：检测内容与要求：送样人姓名：
送样人联系电话：
送样人E-mail地址：
测量条件：
仪器型号：仪器条件：加速电压：
检測结果：
倍率标尺：分析结果：必要的说明：
分析单位(公章)
分析人：
批准人：
分析日期：
年
月
日
报告书共 页
分析单位地址：
分析单位联系电话：
5 GB/T 27765—2011
附录B （资料性附录）
环氧树脂Epon812包埋剂配制比例参考
环氧树脂Epon812包埋剂配置顺序：DDSA→MNA-→812→+DMP-30。具体见表B.1。
表 B. 1
812 5 g 10 g 15 g
总量 10 mL 20 mL 30 mL
DDSA 2 g 4 g 6 g
MNA 3 g 6 g 9 g
DMP-30 0.16 mL 0.32 mL 0.48 mL
6 GB/T 27765—2011
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国纳米技术标准化技术委员会（SAC/TC279)提出并归口。 本标准负责起草单位：中国人民解放军第二军医大学、复旦大学及地科院矿产资源研究所。 本标准主要起草人：杨勇翼、俞彰、周健雄、张天宝。
H GB/T27765-2011
SiO2、TiO2、Fe304及Al203纳米颗粒生物效应的透射电子显微镜检测方法
1范围
本标准规定了透射电子显微镜检测含有SiO2、TiO2、Fe:O.及Al2O：纳米颗粒材料的生物试样的技术和规范。
本标准适用于SiO2、TiO2、FesO，及Al2O3纳米颗粒材料的生物效应透射电镜检测的生物薄试样超微结构分析。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T18873—2008生物薄试样的透射电子显微镜-X射线能谱定量分析通则 GB/T19619-2004纳米材料术语 ISO/IEC17025：2005检测和校准实验室认可准则（Generalrequirementsforthecompetenceof
testingandcalibrationlaboratories)
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3. 1
纳米颗粒nanoparticles 纳米尺度的固体粒子。本标准中出现的纳米颗粒材料特指为SiO2、TiO2、Fe:O4及Al2O，纳米颗
粒材料。 3. 2
生物效应biologicaleffect 纳米材料与生命过程的相互作用产生的生理功能、生化功能及形态结构的变化。
3. 3
生物效应检测biologicaltest 采用生物学、化学、毒理学与医学等领域的实验技术进行检验测量。
3. 4
生物薄试样thinbiologicalsample 生物薄试样是指采用超薄切片机切成的、厚度为40nm～100nm的生物试样，用于透射电镜观察。
4基本原理
纳米颗粒材料的表面理化特性使其易形成团聚，经分散后与生物体接触。纳米颗粒材料与生物体接触后，需采用超微结构制样方法，将其制成生物薄试样，在透射电镜下检测纳米颗粒材料作用于生物
1 GB/T27765--2011
体后产生的细胞及细胞器的超微结构变化，以确定纳米颗粒材料对生物体的生物效应作用。用案焦的高能电子束照射生物薄试样的微小区域，人射的电子束大部分透过薄试样，形成透射电子，透射电子中含有大量携带有生物薄试样内部信息的非弹性散射电子，非弹性散射电子在荧光屏、照相底片或CCD 上成像，形成生物薄试样的超微结构图像。
5仪器设备和材料
5.1 仪器设备 5.1.1 透射电子显微镜。 5.1.2 超薄切片机。 5.1.3 制刀机。 5. 1. 4 玻璃刀或钻石刀。 5.1.5 恒温烘箱（30℃~70℃）。 5.1.6 超声波清洗仪。 5.2材料 5.2.1 戊二醛。 5.2.2 四氧化钱。 5.2.3 乙醇。 5.2.4 丙酮。 5.2.5 环氧树脂。 5.2.6 醋酸双氧铀。 5.2.7 枸橡酸铅。
6 仪器的环境条件
超薄切片机、透射电子显微镜的工作环境应符合以下要求： 6.1超薄切片机 6.1.1切片室应为超薄切片专用房间。 6.1.2相对湿度小于60%。 6.1.3温度：(20±5)℃。 6.1.4电源电压：220(1士10%)V。 6.2透射电子显微镜 6.2.1 电镜室应为电镜专用房间。 6.2.2相对湿度小于60%。 6.2.3温度：(20±5)℃。 6.2.4 杂散电磁场于扰应小于0.1μT。 6.2.5 电源电压及频率应稳定[220(1±10%)V，50Hz士1Hz]。 6.2.6具备仪器专用地线，接地电阻应小于100Q。
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2 GB/T27765—2011
7纳米颗粒材料分散
7.1将纳米颗粒材料与溶剂按一定的比例充分混和。 7.2放人超声波清洗仪中分散。
注：建议分的条件：水温（25～30)℃；功率300W；频率40(1士10%）kHz；时间30min左右。
8生物薄试样制备
8.1纳米颗粒材料 8.1.1将不同浓度、已分散的纳米颗粒悬液滴在有支持膜（一般用火棉胶或Fomvar膜）的$3mm透射电镜专用载网上。 8.1.2将滴有纳米颗粒材料悬液的电镜专用载网放人恒温烘箱中，60℃烘烤2h。 8.2生物组织 8.2.1取材：将生物组织在(2～3)%戊二醛固定液（4℃)中迅速切成小于1mm的小块。配制戊二醛固定液可参考附录C。 8.2.2前固定：将小块组织浸泡在20倍体积、4℃的（2～3）%戊二醛固定液中固定（1～4)h，用缓冲液充分漂洗。 8.2.3后固定：将生物小块组织浸泡在1%钱酸，4℃固定2h。配制钱酸可参考附录D。 8.2.4脱水：用乙醇或丙酮梯度脱水。建议乙醇或丙酮梯度脱水的顺序为：30%、50%、70%、90%乙醇各一次；90%丙酮1次，100%丙酮3次，每次（10~15）min。 8.2.5包埋：在按比例配制好的环氧树脂（以Epon812为例，配制比例可参考附录B)中浸透后，在胶囊 (或硅胶包埋板）内进行包埋。建议浸透比例为，丙酮：包埋剂（漫透时间）：1：1[(1～2)h]；1：2(12h)；纯包埋剂(1h）。 8.2.6聚合：在恒温烘箱内进行聚合，37℃聚合12h后，升温至60℃聚合（36～48)h。 8.2.7修块：包埋块在进行超薄切片之前，将分析部位修成易于超薄切片的形状。 8.2.8超薄切片：采用超薄切片机将已修好的包埋块切成超薄切片，厚度般要求在（40～100)nm。 8.2.9染色：采用醋酸铀和枸橡酸铅对超薄切片进行双重金属染色后待检。 8.3培养细胞 8.3.1 前固定：用橡皮刮将细胞从培养血底部刮下或胰酶消化下来，低速离心（800g，5min）成小团块，弃上清，沿管壁加人（2～3)%戊二醛固定液，放人4℃冰箱固定（1～4)h。用缓冲液充分漂洗。 8.3.2后固定：经戊二醛固定的细胞团块用缓冲液轻轻漂洗后，加人1%钱酸，放入4℃冰箱固定1h。 8.3.3脱水(同8.2.4)。 8.3.4 包埋（同8.2.5）。 8.3.5合(同8.2.6)。 8.3.6 修块（同8.2.7)。 8.3.7 超薄切片（同8.2.8）。 8.3.8染色（同8.2.9)。
3 GB/T27765—2011
9透射电子显微镜准备工作
9.1开机，抽真空至电镜正常工作所需的高真空后再稳定30min以上。 9.2选择测试生物薄试样所需的加速电压，建议检测生物薄试样所需的加速电压选择在60kV~ 120kV之简。 9.3调节电子枪的灯丝电流，使束流处于稳定饱和状态。 9.4对电子光学系统进行对中调整，尽可能消除电子束的像散，使透射电子显微镜处于最佳工作状态。
10 测置分析步骤
10.1纳米颗粒材料 10.1.1将干燥的纳米颗粒薄试样放人透射电镜。 10.1.2在低倍（3000倍～4000倍）下寻找合适的试样部位，要求被分析试样无破损、无污染。 10.1.3在高倍（40000倍～50000倍）时观察纳米材料的分散情况，测量纳米颗粒的粒径并记录实验结果。 10.2生物薄试样 10.2.1在低倍（小于4000倍）下寻找合适的生物薄试样部位，要求被分析试样无破损、无污染、无震颤条纹。 10.2.2将确定的试样分析部位置于电子显微镜的观察中心。 10.2.3逐步增加放大倍数（一般放大倍数在10000～30000即可，少数需放大30000倍以上），寻找细胞内外、细胞器内外有无纳米材料。 10.2.4仔细分析纳米材料分布的位置，注意区分样品制备过程中引人的污染物和纳米颗粒材料。如果无法判别，建议采用X射线能谱分析对颗粒物进行定性分析，分析方法参见GB/T18873-~2008。 10.2.5精确聚焦并存储实验结果。
11分析结果的发布
分析结果报告应包括以下信息（参见附录A），亦可参照ISO/IEC17025：2005中有关分析报告格式。 11.1分析报告的惟一编号。 11.2送样人姓名，单位和地址。 11.3样品的接收日期。 11.4分析仪器及其工作条件。 11.5分析结果和必要的说明。 11.6分析报告负责人的签字。 11.7分析报告的页码。 11.8实验室名称和地址。 11.9分析报告的日期。
4 GB/T27765-—2011
附录A (资料性附录）
SiO2、TiO2、Fe;04及Al,O;纳米颗粒生物效应的透射电子显微镜分析结果报告
报告编号：送样单位：送样日期：样品内容：检测内容与要求：送样人姓名：
送样人联系电话：
送样人E-mail地址：
测量条件：
仪器型号：仪器条件：加速电压：
检測结果：
倍率标尺：分析结果：必要的说明：
分析单位(公章)
分析人：
批准人：
分析日期：
年
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报告书共 页
分析单位地址：
分析单位联系电话：
5 GB/T 27765—2011
附录B （资料性附录）
环氧树脂Epon812包埋剂配制比例参考
环氧树脂Epon812包埋剂配置顺序：DDSA→MNA-→812→+DMP-30。具体见表B.1。
表 B. 1
812 5 g 10 g 15 g
总量 10 mL 20 mL 30 mL
DDSA 2 g 4 g 6 g
MNA 3 g 6 g 9 g
DMP-30 0.16 mL 0.32 mL 0.48 mL
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