ICS 07.030 CCS C 04
GB
中华人民共和国国家标准
GB/T41309—2022/IS029701:2010
纳米技术 纳米材料的内毒素
体外测试 鲨试剂法
NanotechnologiesEndotoxin test on nanomaterial samples for in vitro
systems--Limulus amebocytelysate(LAL)test
(ISO29701:2010,IDT)
2022-03-09发布
2022-10-01实施
国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会
发布 中华人民共和国
国家标准
纳米技术 纳米材料的内毒素
体外测试 鲨试剂法
GB/T41309—2022/ISO29701:2010
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N
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前言
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件等同采用ISO29701：2010《纳米技术 纳米材料的内毒素体外测试 鲨试剂法》。 本文件增加了“规范性引用文件”一章。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任本文件由中国科学院提出。 本文件由全国纳米技术标准化技术委员会（SAC/TC279)归口。 本文件起草单位：中国医学科学院基础医学研究所、北京大学、首都医科大学、中国食品药品检定研
究院、苏州大学。
本文件主要起草人：孟洁、温涛、许海燕、贾光、孙志伟、徐丽明、陈丹丹、王杨云。
I GB/T41309—2022/IS029701:2010
引言
内毒素（脂多糖LPS)是革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、假单胞菌、奈瑟球菌和嗜血杆菌等细胞壁外膜的一部分。内毒素可引起包括人在内的哺乳动物的各种全身反应，例如发热、弥散性血管内凝血、低血压、休克和死亡。这些反应由多种细胞因子、补体系统和凝血系统级联激活等介导。日常环境中也存在内毒素。纳米材料的体外和体内测试体系中，大多数测试都要经过多种制备过程；制备时需要特别小心，否则内毒素很有可能会污染纳米材料。
为了纳米材料的毒性筛查、生物相容性测试、研究纳米材料导致的毒性机理，开发和使用了多种基于细胞的体外测试系统和动物模型。其中，作为体内主要监视细胞的巨噬细胞和其他相关哺乳动物细胞，常用作测试细胞，这些细胞对内毒素具有高度反应性，难以区分反应是由内毒素还是纳米材料引起的。因此，内毒素的污染会干扰体外试验的结果。
在准备待测样品时遵循适当的预防措施，可减少内毒素污染。为尽量减少内毒素的污染或确定测试样品中不显著的内毒素，需要对内毒素进行初步检测。为了充分解释体外生物测试系统中获得的数据，量化内毒素水平也非常重要。
内毒素也可能会污染非肠道途径应用的医疗器械和药物，因此已经开发出定量和半定量测定方法，对体内和体外内毒素进行检测，用于监管及对纳米材料相关实验室操作程序进行标准化（见参考文献 [6]。使用鲨试剂(LAL)检测细菌内毒素已被开发为一种体外检测方法，可测试内毒素污染的存在；鲨试剂法作为免热原检测的一种替代方法，在许多国家的药典中都有描述。
本文件提供了体外生物测试时利用鲨试剂（LAL)检测纳米材料样品的注意事项。
I GB/T41309—2022/IS029701:2010
纳米技术 纳米材料的内毒素
体外测试 鲨试剂法
1范围
本文件描述了应用鲨试剂法(LAL)评价体外生物系统应用的纳米材料的内毒素水平。该测试方法适用于检测分散在水、血清或反应液等水性溶液中的纳米材料，这些介质可与纳米材料在37C孵育一定时间。
本文件适用于体外样品的检测，同时这些方法也适用于通过非胃肠道途径应用到动物体内的纳米材料。
2 规范性引用文件
本文件没有规范性引用文件。
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
凝固蛋白原 coagulogen LAL试剂中可凝固的蛋白，在内毒素引起的凝胶形成中发挥首要作用。 注：来源于日本鲨（Tachypleustridentatus）凝固蛋白原含有175个氨基酸，分子量为19723（见参考文献[7])。
3.2
凝固蛋白 coagulin 凝固蛋白原被LAL试剂中的凝固蛋白酶酶解后的产物。 注：来源于日本鲨（Tachypleustridentatus）凝固蛋白含有N末端片段（丙氨酸1-精氨酸18)和C末端片段（甘氨酸
47-苯丙氨酸175)（见参考文献[7])。
3.3
内毒素 endotoxin 革兰氏阴性菌细胞壁外部成分的一部分。 注：主要的活性成分是脂多糖(LPS)。
3.4
内毒素单位 endotoxin unit EU 内毒素活性的标准单位。 注1：根据世界卫生组织（WHO)生物标准化专家委员会（ECBS)1996年制定的内毒素单位定义，0.1ng大肠杆菌
0113：HK10：K(一)来源的WHO内毒素参考标准品（RSE)的活性为10EU/ng（见参考文献[8])。 注2：EU等同于内毒素的国际单位（IU)。
3.5
拉姆达 lambda 入
1 GB/T41309—2022/ISO29701:2010
标识凝胶LAL法鲨试剂的灵敏度或者显色鲨试剂法、浊度鲨试剂法标准曲线以EU/mL为单位的最低内毒素浓度。 3.6
鲨试剂 JLimulusamebocytelysate;LAL 从美洲鲨或东方鲨血细胞中提取的裂解物。
3.7
鲨试剂测试 Limulusamebocytelysatetest;LALtest 利用LAL检测细菌内毒素的测试。 注：在药典中LAL测试被称为细菌内毒素试验（BET)
3.8
光密度 optical density;OD 特定波长单位距离内光学元件的光吸收。
3.9
测试样品 testsample 需要测试的纳米材料的分散液或浸提液。
缩略语
4
下列缩略语适用于本文件。 BET：细菌内毒素检测（bacterialendotoxintest） CSE：对照标准内毒素（controlstandardendotoxin） ECBS：生物标准化专家委员会（expertcommitteeonbiologicalstandardization） EF：无内毒素（endotoxin-free) EU：内毒素单位（endotoxinunit） I/EC：抑制/增强对照(inhibition/enhancementcontrol) LAL：鲨试剂(Limulusamebocytelysate) LPS：脂多糖(Lipopolysaccharide) OD：光密度（opticaldensity） RSE：内毒素参考标准品（referencestandardendotoxin） WHO：世界卫生组织（WorldHealthOrganization）
5 测试前考虑因素
5.1 纳米材料的储存
由于纳米材料的表面积大，能吸附包括内毒素在内的多种污染物。因此，纳米材料在使用前应收集并储存在无内毒素、可封闭的容器（例如玻璃器具)中。应使用合适的阴性对照，例如无内毒素的金属氧化物粉末，如二氧化钛、二氧化硅等，来验证无内毒素污染。
注1：由于存在可能对LAL测试产生干扰的因素（见附录A)，宜避免使用聚丙烯一类材质的的塑料制品储存纳米
材料。 注2：无内毒素的金属氧化物纳米材料能通过热处理获得（见5.2）。
5.2储存容器
为去除内毒素，用来储存纳米材料和测试样的玻璃器具和其他热稳定的容器，宜经过不低于250℃ 2 GB/T41309—2022/ISO29701:2010
持续至少30min，或经过其他验证的温度和时间组合处理（例如180℃至少3h，或650℃1min）。商业化灭菌的、无内毒素的聚苯乙烯容器也能用于储存纳米材料。 5.3纳米材料的处理
室内环境中的灰尘通常含有大量的内毒素。在纳米材料制备和处理过程中应特别注意避免接触灰尘。需要具备洁净空气的实验条件（见7.5）。
6测试样品
6.1水分散液
水中可分散的纳米材料可以直接进行LAL测试，也可利用无内毒素水稀释后检测。 6.2水浸提液
纳米材料经无内毒素的反应介质、生理盐水或者其他浸提介质浸提后，可作为LAL测试的样品。
7测试样品的准备
7.1分散方法
测试分散液可以用下面一种或几种方法制备：
手动研磨；
一 机械研磨；
超声分散。
-
分散介质由特定体外检测的目标和特点决定。 注：纳米材料具有大表面积、多孔性、疏水性和其他导致分散困难的特性，因此需要发展新的方法。
7.2浸提方法
浸提的条件，例如浸提液、孵育浸提时间、浸提温度和测试样浓度可模拟相关体外测试的浸提条件。 为避免颜色的干扰，优选没有pH指示剂(酚红)的反应介质或缓冲盐水作为浸提介质。浸提介质宜确认无内毒素或由无内毒素试剂配制。在浸提介质中添加抗生素和抗真菌药物可以有效防止细菌和真菌的生长。宜验证所添加的抗菌物质对LAL试剂的干扰（见8.3.3）。浸提后，浸提复合物需要离心去除颗粒物；作为LAL测试的测试样品的上清液需要利用无内毒素枪头收集到无内毒素的管或容器中。 包括离心条件在内的浸提条件应确认并做记录，其中离心条件需要根据所要研究的纳米材料来确定。
注1：宜用0.05%聚山梨醇酯20作为玻璃纤维过滤器中气相内毒素的浸提液（见参考文献[9])。 注2：0.1%的维生素E表面活性剂（维生素E聚乙烯醇-1000珑珀酸酯)可以改善碳纳米物体内毒素的浸提效果（见
参考文献[10]]。
注3：更多浸提的方法信息，见ISO10993-12；2007。 7.3浓度
如果有必要，测试样品应以细胞体外测试中的最高浓度分散在无内毒素水中。 7.4测试样品的储存
由于测试样品在储存过程中会发生内毒素降解或细菌生长，样品制备后应尽快进行检测。测试样品应在2℃～8℃条件下储存在无内毒素、可封口的容器中（见5.2）。如果测试样品存储时间超过
3 GB/T41309—2022/IS029701:2010
24h，应验证测试样品在储存过程中的稳定性和均一性。 7.5实验环境 7.5.1自来水和空气洁净度
室内环境中自来水和灰尘通常含有大量的内毒素。纳米材料应利用无内毒素介质和无内毒素设备，确保在无菌环境下制备。除非特别说明，当可能存在室内内毒素污染问题时，应在实验场所启用空气洁净度达到ISO5级标准（见ISO14644-1)的洁净间、洁净台或者与类似的空气净化装置。关于空气洁净的规定，见ISO14644-1、ISO14644-2和ISO14644-7。 7.5.2设备和实验器具
制备测试样品使用的器材和实验室玻璃器需要经过不低于250℃C持续至少30min，或其他证实有效的温度和时间组合（例如180℃至少处理3h或650℃处理1min)的处理，以去除内毒素。热不稳定或不适合用热处理的材料应用其他方法减少内毒素。碱或氧化剂浸泡后再用无内毒素水冲洗是一种有效去除内毒素的方法，处理后不会有残留干扰测试。一些实验器具，包括容器、试管和移液器枪头，有商品化的无内毒素塑料制品。
注：当使用塑料制品时，宜使用聚苯乙烯材料。 7.5.3洗涤水
水是设备和实验室器皿中检测到的内毒素的来源之一。在经过内毒素去除处理之后，蒸馏水可用来冲洗这些设备和实验室器血。尽管蒸馏能够有效地去除污染水中的内毒素，但是室内制备的蒸馏水可能由于设备使用不当或者处理不当，导致内毒素污染（见参考文献[11]。应定期检测室内制备的蒸馏水的内毒素水平，以确保其含量在很低水平。如果无法避免蒸馏水中的内毒素，宜使用市售的无内毒素水。
8测试方法
8.1原理
内毒素活化LAL试剂中的个因子，引起蛋白级联酶解反应（见参考文献[12])。凝固酶原被活化因子活化后，释放凝固酶，进而催化凝固蛋白原产生凝固蛋白。凝固蛋白自发地通过二硫键结合，使 LAL浑浊，最终形成凝胶。凝胶的形成原则上通过倒置试管后肉眼检查决定。这种方法不需要光学检测仪，且易操作。现有最灵敏的商业化凝胶鲨试剂的最低检测限为0.015EU/mL。
注：凝胶方法的实际操作步骤见附录B。 8.2可选择的测试方法 8.2.1终点显色方法
在特定的反应时间后，测量反应混合物的光密度（OD）。终点显色法有两种技术：一种是通过浊度测量检测反应混合物的混浊度，一种是利用显色技术检测从合成基质释放的对硝基苯胺（p-NA)，例如凝固酶敏感的叔丁氧炭基-亮氨酸-甘氨酸-精氨酸-对硝基苯胺(Boc-Leu-Gly-Arg-p-NA)或叔丁氧炭基苏氨酸-甘氨酸-精氨酸-对硝基苯胺（Boc-Thr-Gly-Arg-p-NA）。由于灵敏度低和在指定的时间点无法停止混浊的产生，动态比浊法已经取代了简单的比浊法（见7.2.2)。测量反应混合物中的p-NA至少有两种方法：
一一种是直接测量p-NA在405nm波长处的OD值；
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