第35卷，第8期 2015年8月
光谱学与光谱分析 Spectroscopy and Spectral Analysis
Vol.35,No.8-pp2170-2175
August,2015
酵母同步细胞的Percoll连续密度梯度改良方法分离及其
单细胞拉曼光谱鉴别
黄庶识，2，赖钧灼3，卢明倩，程琴，廖威”，陈丽梅*
1，昆明理工大学环境科学与工程学院，云南呈贡650500
2.广西科学院生物物理实验室，广西南宁530007 3，广东文理职业学院，广东湛江524400
4，广西亚热带作物研究所，广西南宁530001
摘要利用改良后的Percoll连续密度梯度分离方法，分离不同酵母菌株稳定期的同步细胞，并在单细胞水平上，应用激光光拉受光谱对分离的同步细胞进行鉴别。采用高速离心机角式转头和2mL聚丙烯离心管，20℃，19320g离心15min，将大约1.75mLPerooll溶液形成1.00～1.31g*mL-连续密度梯度；将样品均匀铺加在离心管连续密度梯度液顶层，20℃，400g离心60min，酵母分成明显的2层细胞带；微分干涉差显微镜(DIC）、相差显微镜以及同步生长曲线分析显示，下层酵母细胞以单个细胞为主，大小均匀、致密，折光性强，生长现阶梯式增长，具有同步细胞生长的特性，确定其为同步的G。细胞。利用单细胞光最拉受光谱系统对所分离的G。同步细胞与非G。细胞进行分析，结果显示G司步细胞和非G细胞的特征峰位置基本一致，但G。细胞对应的蛋白质、糖类、核酸等生物大分子特征峰强度大于非G。细胞，说明G 细胞大分子物质含量要比非G。细胞的高：对G细胞和非G。细胞进行主成分分析，结果显示，分离的同步化G，细胞之间成分含量差异少，比较均一，而非同步细胞之间内含物质差异大，呈不均一性，说明单细胞光镊拉受光谱系统可以鉴别同步和非同步细胞。改良后的Percoll连续密度梯度分离方法，能够分离多数酵
母菌株同步化细胞，是一种易操作、成本低、效率高的细胞分离方法，关键词酵母；Perooll密度梯度离心；同步细胞；拉曼光谱
中图分类号：0657.3
3文献标识码：A
引言
DOI: 10, 3964/j. issn.1000-0593(2015 )08-2170-06
不同密度层内，据此可以有效分离在Percoll中浮力密度 1.00～1.20g·mL-范围的大多数细胞、亚细胞颗粒、细菌以及小于70S的病毒。根据分离对象不同，可以将Percoll制
Percol(硅石胶态息浮液)作为密度梯度介质分离各种细胞的方法已广泛应用于细胞生物学、临床医学、微生物学等领域。采用Pereoll分离剂分离动物细胞1-3]、微生物4]、质膜5.6、胞质膜“、亚细胞器、病毒*和其他微粒”等，能获得纯度较高、活力良好的细胞或亚细胞微粒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。
Percoll是用聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylPyrolidone， PVP)包裹的硅胶颗粒，颗粒大小不一，直径大约15～30 nm，用生理盐水或其他平衡盐或细胞培养基调整，通过离心方法在1.00～1.30gmL-的密度范围内可以形成等渗梯度，而不同密度的细胞或者碎片在离心力作用下可以分布于
收稿日期：2014-06-11，修订日期：2014-09-25
备成连续密度梯度或非连续密度梯度。连续密度梯度形成通常使用具有悬垂转头的离心机制备；非连续密度梯度的制备是将Percoll稀释配制成系列所要求的密度，然后依次铺加到离心管中形成非连续的等渗梯度。
大多数情况下，研究人员根据不同的研究目标在应用连续密度梯度法分离合乎研究条件的细胞过程中，必须使用超高速离心机垂直转头才能满足制备连续密度Percoll梯度的要求，同时还需使用较为昂贵Corex离心管分离细胞。同时，为了获得纯化的细胞，对于离心分层的细胞往往采用穿刺法破坏Corex管取得，Corex管不能循环使用，在每次实验中 Peroll试剂和样品的用量大，实验成本高，尤其只需要少量
基金项目：国家自然科学基金项目（31160018)和广西科学院基金项目（13YJ22WL08)资助
e-mail : hshush@ gxas, cn
作者简介：黄庶识，1964年生，广西科学院研究员
*通讯联系人e-mail：chenlimeikm@126.com