施工应用
乙醛脱氢酶基因敲除对明串珠菌产甘露醇的影响
王立东成文玉金红星（河北工业大学化工学院，天津
300130）
摘要：为了提高甘露醇产量，研究了乙醛脱氢酶基鼓除对明串珠菌碳代谢的影响。利用四环素抗性基固构建了携带抗性标记的同源重组载体；将携带抗性标记的同源重组载体酶切产生无抗性标记的同源重组载体；经过两次同源重组获得了乙醛脱氢酶基因鼓除菌袜即突变首探。三基团鼓除的突变菌袜Leu△dtsldhAaldh甘露醇产量(9.35g/L)比原始菌林(7.87g/ L)提高18.8%，乙醇含量产量下降了62%。
关键词：明事珠菌；基固鼓除；乙醛脱氢酶；甘露醇；乙醇甘露醇是一种已六醇，在医药、食品、电子和化工等众多领
域均得到广泛的应用"。目前，工业生产甘露醇主要有两种工艺：海藻提取法在生产过程产生大量废水、污染严重、收率低；催化加氢法的产率较低、且有山梨醇伴生。实验室生产甘露醇的方法有两种：酶转化法在体系中加人昂贵的辅酶，不经济，微生物发酵法不产生其它多元醇等副产物且条件温和。产甘露醇的微生物中，明串珠菌由于基因组较小、转化率较高，因此有着明显的优势。明申珠菌是进行异型乳酸发酵的G'，是FDA认可的GRAS菌，因没有醚缩酶而不进行糖醇解，底物通过PPK途径而脱氢并产生能量"
本文操讨了乙醛脱氢酶(alkdh)基因除对明串珠菌产甘露醇的影响，从而揭示了碳代谢中通量变化规律，为明串珠菌的遗传育种莫定了理论基础。
1材料和方法 1.1材料
菌株与质粒：肠膜明串珠菌CGMCC1.10327，大肠杆菌 DH5α，质粒pTA2-Tet，大肠杆菌-明串珠菌穿梭载体pCW4均由本实验室保存。
培养：大肠杆菌用LB培养基培养，明串珠菌用MRS培养基
A
12
B 4095te 544 bp
12
569 bp
c
培养。
内切酶为TAKARA的，TaqDNA聚合酶为天津谦泰的，化学试剂为分析纯。
所用到的引物列于表1。
表1引物
Primer P1 P2 P3
PS P6 P7 P8
1.2方法
(.E.s)ouanbos
AGTGGTAC CCCGAAGGTCATGCACTG(KpnI) ATTCTCGAGCCAGCACGTTCTGAACC(XhoI) TATCTGCAGGGACAGGTATGTACTTC (PstI) GCCTCTAGATTGTTCACAAAGGTTTC (Xbal) CCGCTCGAGTGCTGAAAATATCACAA(Xhol) CCGCTCGAGTTAACCAATGATAACCA(Xhol)
CCGAAGGTCATGCACTGT CTTGTTCACAAAGGTTTC
1.2.1乙醛脱氢酶基因固部分序列的克降
参照Vingataramin等的方法"提取明申珠菌染色体DNA并做模板，PCR扩增了乙脱氢酶基固aldh，构建了载体pTA2-al-dh
1.2.2aldh的同源重组载体与互补型载体的构建
pTA2-aldh做模板，以P1P2,P3P4为引物，分别扩增aldh 的前，后同源臂aldh-L和aldh-R，并分别插入到pTA2-Tet质粒的KpnI和Xhol,Pstl和Xbal酶切位点上，构建了携带抗生素抗性标记的源重组载体pTA2-aldhLTet-aldh，用EecoRI酶切 pTA2-aldhL-Tet-aldhR而去除四环素表达盒，获得了无抗生素抗性标记的同源重组载体pTA2-aldhL-aldhR。
以明串珠菌染色体DNA为模板，利用P5-P6引物PCR扩
增了aldh基因表达盒，插人到pCW4的Xhol酶切位点上，构建
12
2980bp 1113 hg
D
12
selp 1546 bp
A:pTA2aldhLTet质粒酶切验证图：1,200 bp Laddermarker;2.酶切产物：aldhL(544 bp).pTA2Tet(4295bp）
B:pTA2aldhLTetaldhR质粒酶切验证图;1,200 bp Ladder marker;2.酶切产物：aldhR(569 bp).pTA2aldhLTet(4839 bp)(8 D：互补型表达载体pCW4-aldh酶切验证图：1.200bpLaddermarker;2.酶切产物：pCW4(5300bp)aldh(1546bp）
图1同源重组载体与互补型载体的验证
Fig.1 Verification of homologous recombinant vectors and complementary vector
2017年08月
万方数据
化工准理
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