NY/T 3677-2020
家蚕微孢子虫荧光定量PCR检测方法
Real time PCR method for detection of Nosema bombycis
2020-08-26发布
2021-01-01实施
5.7 FTA卡滤膜片。
5.8 FTA纯化试剂。
5.9 荧光定量 PCR试剂盒。
5.10 灭菌的枪头、离心管及牙签。
6 主要仪器设备
6.1 实时荧光定量 PCR仪。
6.2 紫外分光光度计。
6.3 小型珠路式织研磨器。
6.4 破碎管。
6.5 微量加样器。
6.6 微里打孔器。
6.7 一20℃及-80℃冰箱。
7 样品检测
7.1 样品微孢子虫基因组 DNA提取
7.1.1 将待检企印样品充分混匀，随机选取 200 粒蚕卵用30%KOH溶液在37℃中浸没 10 min，一级水冲选2次.1 mol/L. HCI中和1次，一级水冲洗2次，用灭菌牙签将蚕卵充分捣碎。称取待检蚕体组织约200 mg，在冰上快速用灭菌勇刀将其剪碎。
7.1.2 将
7.1.1处理过的卵样品或蚕体组织样品置于2mL.破碎管中.加入1/2管体积的玻璃珠及1ml.TE缓冲液，使用小型珠磨式组织研磨器，4 800 g，室温振荡破碎】 min.将样品置于冰上，待其冷却后再重复振荡破碎5次。
7.1.3 吸取 100 μL，破碎液滴加到 FTA卡滤膜片上，室温干燥。
7.1.4 从FTA卡滤膜片上打孔裁取1个直径约2 mm 的小圆片·用FTA纯化试剂洗涤3次，然后用TE-1缓冲液洗涤2次，56℃干燥后一20℃冷冻保存备用。作为荧光定量的模板。
7.2 实时荧光定量 PCR检测
7.2.1 引物序列
正向引物∶5'GGATCAATAGGATGTCATAACC3';
反向引物∶5'-TGTTCATICGCCACTACTAA-3'。
荧光定量 PCR产物相关信息参见附录 A_