NY/T 3691-2020
粮油作物产品中黄曲霉鉴定技术规程
Technical code of practice for identification of Aspergllus flavus in grain and oil crops
2021-01-01实施
2020-08-26发布
6 仪器设备及试剂材料
6.1 仪器设备
除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备如下∶
生物安全有.高压灭菌留，在温培养箱，烘箱.登型粉容机.台式冷冻离心机.台式小型离心机，制冰机，旋涡泰荡器，恒温水浴钢、水平揉床，恒混摇床，常规冰箱，超低温冰箱、生物显微镜、PCR 仪、核酸蛋白分析仪，凝胶电冰仪、聚胶成像系饺、做量移液器等。
6.2 试剂与材料
除先有规定外，所用试剂均为分析纯∶实验室用水符合GB/T6682 的相关要求。
DG18培养基、察氏培养基及 AFPA培养基配制方法见附求A∶分子生物学鉴定所用试剂及配制方法见附录B 和附录C。
7 黄曲霉鉴定
7.1 样品处理
称取10g待检样品，用研钵或微型粉碎机轻微破碎，加入含 90 mL.无菌水的锥形瓶中，室温涡旋振荡或水平播床上充分混匀，加无菌水定容配制100 ml样晶基确液。吸取1 ml.配制的基础液加入含9 mL 无菌水的离心管中，按照GB 4789.15.依次 10倍梯度稀释，分别得到1×10-1，1×10-²、1×10-、1×10-、1×10-稀释度的南悬液。
7.2 黄曲霉分离与纯化
按照GB 4789.15，吸取每个稀释浓度的蔺悬液 100 μ.涂布于IXG18 培养基平板上，置于恒温培养箱。在25℃、相对湿度 9%，提啼条件下培养3d～5d.每个稀释度处理重复3次。挑取外观长有黄绿色孢子的菌落转接至新的 ID18培养基平板上进行二次划线纯化培养∶直至得到单菌落;为霉菌的纯培养物（待测菌株），培养条件同上。
7.3 黄曲霉鉴定方法
7.3.1 形态鉴定
7.3.1.1 AFPA培养鉴定
将7.2中待测菌株接种于选择性培养基AFPA平板上·培养条件同7.2。将平板倒转.培养3d～5 d. 观察菌落青面颜色.选取菌落背面呈亮楼色的菌株，备用。
7.3.1.2 察氏培养基培养鉴定
根据 GB4789.16，副取
7.3.1.1中亮橙色菌落转接于察氏培养基∶培养5d—7 d后观察菌落形态、颜色，用生∶物显微镜观察分生孢子及分生他子梗的形态特征和孢子的排列等，培养条件同7.2。
7.3.2 分子生物学鉴定
7.3.2.1 DNA提取
从7.3.1.2培养m上利取待测菌株菌丝体;使用市售真菌基因组 DNA提取试剂盒并按照其操作说明快逵提取DNA.或使用CTAB法提取DNA，具体步骤及试剂见附录B。使用核酸蛋门仪或禁外分光光度计进行DNA 浓度和纯度检测。提取的 DNA溶液保存于一20℃备用。
7.3.2.2 PCR扩增
以7.3.2.1中待测南橡DNA为反应模板，以黄曲霉标准菌株DNA作为阳性对照，用真菌鉴定通用引物ITSI/ITS 对待测菌株ITS序列进行PCR扩增分析∶选择曲霉属真菌鉴定引物CFI/CF2或BAl/BA2对待测谨橡Calmcdulin 基因部分片段或β ubulin 基因部分片段进行PR扩增分析∶用黄曲霉特异性鉴定引物进行 P'R扩增验证。PCR引物序列、产物大小、反应体系及反应条件见附录C。