ICS 11.020
CCS C 05
团
体 标 准
T/CRHA 081—2024
————————————————————————————————
————————
油橄榄叶来源的纳米囊泡
Nanovesicles derived from olea europaea leaf
2024-08-22 发布
2024-08-30 实施
中国研究型医院学会 发 布
T/CRHA 081—2024
目
次
前言 ........................................................................ II
引言 ........................................................................ Ⅲ
1 范围 ....................................................................... 1
2 规范性引用文件 ............................................................. 1
3 术语和定义 ................................................................. 1
4 缩略语 ..................................................................... 1
5 技术要求 ................................................................... 2
5.1 原材料和辅料 ......................................................... 2
5.2 产品关键质量属性 ..................................................... 2
5.3 过程控制 ............................................................. 3
5.4 制备工艺 ............................................................. 3
5.5 生产要求 ............................................................. 3
6 检测方法 ................................................................... 3
6.1 感官指标 ............................................................. 3
6.2 理化指标 ............................................................. 4
6.3 卫生指标 ............................................................. 4
6.4 生物活性指标 ......................................................... 4
7 检验规则 ................................................................... 4
7.1 出厂检验 ............................................................. 4
7.2 型式检验 ............................................................. 4
7.3 判定规则 ............................................................. 5
8 包装、标签、储存、运输及保质期 ............................................. 5
8.1 包装 ................................................................. 5
8.2 标签 ................................................................. 5
8.3 运输 ................................................................. 5
8.4 储存 ................................................................. 5
8.5 保质期 ............................................................... 5
附录 A（规范性）油橄榄叶囊泡形态检测方法（透射电镜观察法） ................... 6
附录 B（规范性）油橄榄叶囊泡数量检测方法（纳米流式检测法） ................... 7
附录 C（规范性）油橄榄叶囊泡粒径检测方法（纳米流式检测法） ................... 8
附录 D（规范性）油橄榄叶囊泡数量/粒径检测方法（纳米库尔特粒度仪检测法） ...... 9
附录 E（规范性）油橄榄叶囊泡数量/粒径检测方法（纳米颗粒跟踪分析仪检测法） ... 10
附录 F（规范性）油橄榄叶囊泡纯度（每单位蛋白粒子数）计算方法 ................ 11
附录 G（规范性）油橄榄叶囊泡促进上皮细胞/成纤维细胞增殖检测方法（CCK-8 法） ..12
附录 H（规范性）油橄榄叶囊泡促进上皮细胞/成纤维细胞划痕愈合检测方法 ......... 13
参考文献 .................................................................... 14
I
T/CRHA 081—2024
前
言
本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规
则》的规定起草。
本文件由中国研究型医院学会医疗质量管理与评价专业委员会提出。
本文件由中国研究型医院学会归口。
本文件起草单位：上海科黛生物科技有限公司、北京工商大学、复旦大学基础医学院、
复旦大学公共卫生学院、复旦大学附属华山医院、上海市皮肤病医院、上海交通大学医学院
附属仁济医院、上海交通大学医学院附属第六人民医院、上海中医药大学附属岳阳中西医结
合医院、华中科技大学同济医学院附属协和医院、中南大学湘雅医院、武汉大学中南医院、
南方医科大学皮肤病医院、南方医科大学附属广东省人民医院、广东省第二人民医院、南方
医科大学南方医院、江苏思博赛尔生物科技有限公司、江苏恩赛尔生物科技有限公司、南京
玻得理生物科技有限公司、南京佐佑健康管理有限公司、南京百睿迪生物技术有限公司。
本文件主要起草人：施诺、林琳、朱维、樊杨懿、王蕊蕊、徐思伟、袁菊懋、盘瑶、于
敏、赵冰、王颖、吴文育、邹颖、鞠强、邓辉、李福伦、李延、李吉、谢君、杨斌、刘涛、
熊浩、李东霓、郑跃、许琳、戴荣、徐岩、王珍珍、戴湑、荣家任。
II
T/CRHA 081—2024
引
言
油橄榄叶来源的纳米囊泡既是一种可持续的、绿色的、高效的药物递送载体，也是一种
生物治疗剂在针对炎症性疾病的独立疗法中展现出巨大治疗潜力。然而，作为一种新型的天
然植物来源的生物医药制品，目前尚未有针对油橄榄叶囊泡的质量及检测标准和规范。参差
不齐的参数和质量指标不利于油橄榄叶囊泡在科学研究和应用领域的进一步发展。符合国际
细胞外囊泡学会 (ISEV) 在 MISEV2023 中建议的对囊泡的表征、评估方法，但 MISEV2023
主 要 针 对 人 源 、 哺 乳 动 物 源 的 细 胞 外 囊 泡 ， 对 植 物 囊 泡 并 无 特 定 建 议 。
本文件规定了油橄榄叶来源的纳米囊泡的技术要求、检测方法、检验规则、包装、标签、
储存、运输及保质期处理要求。该标准适用于油橄榄叶来源的纳米囊泡的研究和生产。
III
T/CRHA 081—2024
油橄榄叶来源的纳米囊泡
1
范围
本文件规定了油橄榄叶来源的纳米囊泡的技术要求、检测方法、检验规则、包装、标签、
储存、运输及保质期处理要求。
本文件适用于油橄榄叶来源的纳米囊泡的研究和生产。
2
规范性引用文件
下列文件中的内容通过本文件的规范性引用而成为本文件必不可少的条款。凡是注日期
的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括
所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682
分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 9724 化学试剂 pH 值测定通则
GB/T 27428—2022
植物生物安全实验室
JJG 119 实验室 pH（酸度）计
SN/T 3899—2014 化妆品体外替代试验 良好细胞培养和样品制备规范
T/BDCA 0003—2020 中国特色植物资源化妆品功效评价指南
T/BJWA 011—2023
活性离子水抗氧化测定 ABTS 法
T/ZHCA 016—2022 化妆品舒缓功效评价 斑马鱼幼鱼中性粒细胞抑制率法
中华人民共和国药典（2020 年版）
药品生产质量管理规范（2010 年修订）
3
术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
油橄榄叶来源的纳米囊泡
nanovesicles derived from olea europaea leaf
来源于油橄榄叶质外体汁液的细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）和来源于油橄榄
叶榨汁液的细胞外囊泡样颗粒（Extracellular Vesicles-Like Particles, EVLPs）的两种纳米结构
的统称，简称“油橄榄叶囊泡”。
4
缩略语
下列缩略语适用于本文件。
PS ：聚苯乙烯（Polystyrene）
CCK-8：细胞计数试剂，2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-
四唑单钠盐（Cell Counting Kit-8）
ABTS：2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（2,2'- Azinobis- (3-
ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)技术要求
1
T/CRHA 081—2024
5
技术要求
5.1 原材料和辅料
生产油橄榄叶囊泡的过程中，使用的原材料和辅料应符合 GB/T 27428—2022 要求。
5.2 产品关键质量属性
5.2.1 感官指标要求应符合表 1 的规定。
表 1 感官要求
项目 要求
外观 均匀粉末，无肉眼可见外来异物
色泽 白色至淡黄色
气味 特殊植物气味
5.2.2 理化指标要求应符合表 2 的规定。
项目 要求
囊泡形态 透射电镜下应呈现不聚团的具有清晰膜结构的茶托状或杯状结 构，边缘清晰
囊泡粒径/（nm） 30 - 400
囊泡纯度： 囊泡数量与蛋白量比值/ （颗粒/毫克） ≥ 1×1011
pH 值（1%粉末溶于水） 6 - 8
5.2.3 卫生要求应符合表 3 的规定。
表 3 卫生要求
项目 要求
微生物指标 菌落总数/（CFU/g） ≤ 1000
霉菌及酵母菌数/（CFU/g） ≤ 100
大肠菌群/（MPN/g） 不得检出
金黄色葡萄球菌/（MPN/g） 不得检出
铜绿假单胞菌/ （MPN/g） 不得检出
有害物质限量 汞（Hg）/（mg/kg） ≤ 0.2
2
T/CRHA 081—2024
铅（Pb）/（mg/kg） ≤ 5
砷（As）/（mg/kg） ≤ 2
镉（Cd）/（mg/kg） ≤ 2
铜（Cu）/（mg/kg） ≤ 20
农药残留 <0. 1ppm
5.2.4 生物活性要求应符合表 4 的规定。
表 4 生物活性要求
项目 要求
促进细胞增殖 能够促进上皮细胞和成纤维细胞的增殖
促进愈合 能促进体外培养的上皮细胞和成纤维细胞划痕愈合
清除自由基 能对 ABTS 自由基具有清除能力
抗炎舒缓 能够抑制斑马鱼幼鱼中性粒细胞
5.3 过程控制
应记录油橄榄叶囊泡的提取分离方法。
5.4 制备工艺
5.4.1 预处理
用无菌水提取新鲜的油橄榄叶的质外体汁液或将新鲜的油橄榄叶片进行榨汁破壁预处
理。
5.4.2 分离
目前分离囊泡的方法包括差速超高速离心法、超滤法、尺寸排阻色谱法、免疫亲和捕获
法、聚合物沉淀法、电泳透析法和其他方法。大规模制备时，鼓励使用切向流超滤和尺寸排
阻色谱法相结合分离油橄榄叶囊泡。
5.4.3 冷冻干燥
在高度真空的环境下，对油橄榄叶囊泡悬液进行冷冻干燥。
5.5 生产要求
油橄榄叶囊泡的生产环境条件应至少符合 2010 版 GMP 标准 C 级洁净区的要求。临床
用样品的生产全过程应当符合 2010 年修订的《药品生产质量管理规范》的基本原则和相关
要求。
6
检测方法
6.1 感官指标
6.1.1 外观、色泽检测
取适量样品于比色管内，在室温和非阳光直射处目测观察。
3
T/CRHA 081—2024
6.1.2 气味评定
取适量样品，用嗅觉进行辨别。
6.2 理化指标
6.2.1 囊泡形态
按照附录 A 的方法检测。
6.2.2 囊泡数量
鼓励至少选择一项光学技术（附录 B、E）和一项非光学技术（附录 D）进行表征。
6.2.3 囊泡粒径
鼓励至少选择一项光学技术（附录 C、E）和一项非光学技术（附录 D）进行表征。
6.2.4 囊泡纯度
按照附录 F 的方法检测。
6.2.5 pH 值
取 1%粉末溶于水，按照 GB/T 9724 和 JJG 119 规定的方法检测。
6.3 卫生指标
6.3.1 微生物指标
按《中华人民共和国药典（2020 年版）》规定的方法检测。
6.3.2 重金属指标
按《中华人民共和国药典（2020 年版）》规定的方法检测。
6.3.3 农药残留指标
按《中华人民共和国药典（2020 年版）》规定的方法检测。
6.4 生物活性指标
6.4.1 促进上皮细胞和成纤维细胞增殖
按照 T/BDCA 0003-2020 和附录 G 的方法检测。
6.4.2 促进上皮细胞和成纤维细胞划痕愈合
按照 T/BDCA 0003-2020 和附录 H 的方法检测。
6.4.3 清除氧化自由基
按照 T/BDCA 0003-2020 和 T/BJWA 011—2023 规定的方法检测。
6.4.4 舒缓功效评价
按照 T/BDCA 0003-2020 和 T/ZHCA 016-2022 规定的方法检测。
7
检验规则
7.1 出厂检验
7.1.1 同品种、同一批投料生产的产品，以同一生产日期为一检验批次。
7.1.2 每批产品均应进行出厂检验，并附检验报告。
7.1.3 出厂检验项目：外观、色泽、气味、形态、数量、粒径、蛋白浓度、纯度、pH 值以
及微生物、重金属和农药残留等卫生指标。
7.2 型式检验
7.2.1 型式检验项目包括本文件中规定的全部项目。
7.2.2 正常生产时每年进行一次型式检验。
4
T/CRHA 081—2024
7.2.3 有以下情况之一时，应进行型式检验：
a)
原料来源变动较大时；
b)
正式投产后，如生产工艺有较大变化，可能影响产品质量时；
c)
出厂检验与上一次型式检验结果有较大差异时；
d)
产品停产 6 个月以上，恢复生产时。
7.3 判定规则
7.3.1 检验结果全部符合本文规定时，判该批产品为合格品。
7.3.2 检验结果不符合本文件要求时，可以在原批次产品中双倍抽样复检一次，判定以复检
结果为准。复检后仍有一项或一项以上不符合标准时，判该产品为不合格品。
8
包装、标签、储存、运输及保质期
8.1 包装
在生产后应进行密封包装，包装满足无菌要求。包装内应附使用说明，最小包装上应附
标签。
8.2 标签
标签应包括以下内容：产品名称、批号、规格、执行标准、生产厂名、厂址、产地、生
产日期、保质期、储存条件。
8.3 运输
运输时必须轻装轻卸，不得与有毒、有害、有异味、易污染物品混装载运，严防挤压、
雨淋、暴晒。
8.4 储存
产品应贮存于阴凉、清洁和干燥的仓库中。避免与有毒、有害、易腐、易污染等物品一
起堆放。
8.5 保质期
在符合规定的运输和贮存条件、包装完整、未经开启封口的情况下，保质期按销售包装
标注执行。
5
T/CRHA 081—2024
附 录 A
（规范性）
油橄榄叶囊泡形态检测方法（透射电镜观察法）
A.1 仪器和设备
A.1.1 透射电子显微镜。
A.1.2 Formvar-carbon 载样铜网。
A.2 试剂
本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为 GB/T 6682 规定的一级水。
A.2.1 磷酸盐缓冲液：pH 为 7.4。
A.2.2 1%戊二醛溶液。
A.2.3 饱和草酸双氧铀溶液。
A.3 检测步骤
A.3.1 将附录 A 方法获得的囊泡样本滴加在 Formvar-carbon 载样铜网上，室温静置 20 分钟。
A.3.2 滴加适量磷酸盐缓冲液于样本上，清洗 3 次。
A.3.3 滴加适量 1%戊二醛溶液于样本上，固定 5 分钟，随后用超纯水清洗 8 次。
A.3.4 用饱和草酸双氧铀溶液染色 5 分钟。
A.3.5 铜网在室温下干燥 10 分钟。
A.3.6 将铜网置于透射电子显微镜样本室内，观测囊泡的形态。按照仪器说明书进行。
6
T/CRHA 081—2024
附 录 B
（规范性）
油橄榄叶囊泡数量检测方法（纳米流式检测法）
B.1 仪器和设备
B.1.1 纳米流式仪。
B.2 试剂
本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为 GB/T 6682 规定的一级水。
B.2.1 磷酸盐缓冲液：pH 为 7.4。
B.2.2 纳米流式仪浓度标准品（1.99×1010 个颗粒/毫升）。
B.3 检测步骤
B.3.1 按照使用说明，对纳米流式仪进行液流初始化和管路气泡排出。
B.3.2 用超纯水将浓度标准品稀释 100 倍，按照使用说明进行纳米流式仪的质控，将纳米流
式仪调试到最佳检测状态后（散射和荧光通道的信号均达到最强且均一），在浓度标准品的
测量参数下对稀释后的标准品采集数据（在最佳状态下，质控标准品颗粒计数值范围通常在
5000-7000）。
B.3.3 按照使用说明，依次用洗液和超纯水清洗进样毛细管。
B.3.4 在 Labelled Exo 样品测量参数下检测磷酸盐缓冲液的颗粒数，确保磷酸盐缓冲液的颗
粒数不高于 200，以便作为空白对照的数据采集并用于后续的样品稀释。若颗粒数计数高于
200，则需用 0.22 微米的滤膜过滤。
B.3.5 用洁净的磷酸盐缓冲液将囊泡样品预稀释 100 倍，在 EXO 样品测量参数对囊泡样本
进行数据采集。纳米流式仪颗粒计数在 5000-7000 之间为准确测量范围，若样 品颗粒数计
数过高或过低，则需调整样品的稀释倍数，再进行测定，记下样品的最终稀释倍数。另外需
注意样品上机检测时散射通道的基线和自动阈值与空白对照（磷酸盐缓冲液）检测的基线和
自动阈值是否一致，若样品检测时出现基线抬升，则需重新制备更高纯度的样品。
B.4 结果分析
使用 NF Profession 软件依次进行：浓度标准设置、样品阈值设置、空白对照设置、待测样
品浓度报告生成，最终得到待测样品浓度检测报告。计算囊泡样本数量的公式如下：
X=(B-B)/A×1.99×108×D×E
式中：
X——囊泡样本的数量；
A——测得的标准品颗粒数；
B——测得的（稀释后）样本颗粒数；
C——空白对照的颗粒数；
D——样本的稀释倍数；
E——样本的体积（毫升）。
7
T/CRHA 081—2024
附 录 C
（规范性）
油橄榄叶囊泡粒径检测方法（纳米流式检测法）
C.1 仪器和设备
C.1.1 纳米流式仪。
C.1 试剂
本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为 GB/T 6682 规定的一级水。
C.2.1 磷酸盐缓冲液：pH 为 7.4。
C.2.2 纳米流式仪浓度标准品（1.99×1010 个颗粒/毫升）。
C.3 检测步骤
C.3.1 按照使用说明，对纳米流式仪进行液流初始化和管路气泡排出。
C.3.2 用超纯水将浓度标准品稀释 100 倍，按照使用说明进行纳米流式仪的质控，将纳米流
式仪调试到最佳检测状态后（散射和荧光通道的信号均达到最强且均一），在浓度标准品的
测
量参数下对稀释后的标准品采集数据（在最佳状态下，质控标准品颗粒计数值范围通常
在 5000-7000）。
C.3.3 按照使用说明，依次用洗液和超纯水清洗进样毛细管。
C.3.4 用超纯水将 S16M-EXO 粒径标准品稀释 100 倍，在 S16M-EXO 粒径标准品测量参数
下对稀释后的粒径标准品进行采集数据。
C.3.5 按照使用说明，依次用洗液和超纯水清洗进样毛细管。
C.3.6 在 Labelled Exo 样品测量参数下检测磷酸盐缓冲液的颗粒数，确保磷酸盐缓冲液的颗
粒数不高于 200，以便作为空白对照的数据采集并用于后续的样品稀释。若颗粒数计数高于
200，则需用 0.22 微米的滤膜过滤。
C.3.7 用洁净的磷酸盐缓冲液将囊泡样品预稀释 100 倍，在 EXO 样品测量参数对小囊泡样
本进行数据采集。纳米流式仪颗粒计数在 5000-7000 之间为准确测量范围，若样品颗粒数计
数过高或过低，则需调整样品的稀释倍数，再进行测定，记下样品的最终稀释倍数。另外需
注意样品上机检测时散射通道的基线和自动阈值与空白对照（磷酸盐缓冲液）检测的基线和
自动阈值是否一致，若样品检测时出现基线抬升，则需重新制备更高纯度的样品。
C.4 结果分析
使用 NF Profession 软件依次进行：样品阈值设置、粒径标准曲线拟合、空白对照颗粒扣除、
样品粒径分布直方图生成，最终得到待测样品粒径检测报告。
8
T/CRHA 081—2024
附 录 D
（规范性）
油橄榄叶囊泡数量/粒径检测方法（纳米库尔特粒度仪检测法）
D.1 仪器和设备
D.1.1 纳米库尔特粒度仪。
D.1 试剂
本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为 GB/T 6682 规定的一级水。
D.2.1 磷酸盐缓冲液：pH 为 7.4。
D.3 检测步骤
D.3.1 打开仪器和操作软件。此界面可选择“在线测量”、“实验报告”、“系统
界面”、“用户
管理”等界面。
D.3.2 选择系统参数（首次使用时）。“系统参数”界面中，在“实验模式”处勾选“自动识别”；
在“粒径梯度”处选择 2nm；在“测试时长”处根据测试所需选择自动停止的时间。
D.3.3 录入芯片信息。进入“在线测量”界面，鼠标选中“实验信息录入”框中“二维码信息录入”
处的信息框，用扫码枪扫描芯片包装上的二维码。同时“下一步”的按钮由不可点击的“灰色”
变为可点击的“蓝色”。
D.3.4 录入样本信息。在点击 3.1 步骤中“蓝色”的“下一步”按钮后，即可输入本次实验的“实
验名称”。“测试模式”根据需求选择“粒径测量”；“通道选择”根据芯片包装上的信息选择对
应的“检测通道 A”；“盐浓度”默认为“1”；“稀释比”根据测试
中样本的实际稀释倍数输
入，如“100”。
D.3.5 安装芯片。将芯片放入芯片卡槽的正中央后，用小组件固定住芯片位置。
D.3.6 空白测试。在检测卡两侧样本槽均加入 200μL 的磷酸盐缓冲液。将检测卡插入 A 通
道后，在样本测试界面点击“空白测试”按钮。
D.3.7 样本测试。空白测试正常后，将检测卡样本槽（有蓝色 S 标志的一侧）中的空白稀
释液吸出，用移液枪加入 200μL 已经制备好的样本（对准芯片孔打样），另一侧的空白稀
释液不需要处理。加好样本后，直接点击“记录”按钮开始样本测试。
D.3.8 数据查看和报告导出。测量完成后，点击“实验报告”模块界面左侧可预览历史测量数
据，选中需要导出的数据。
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T/CRHA 081—2024
附 录 E
（规范性）
油橄榄叶囊泡数量/粒径检测方法（纳米颗粒跟踪分析仪检测法）
E.1 仪器和设备
E.1.1 纳米颗粒跟踪分析仪。
E.2 试剂
本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为 GB/T 6682 规定的一级水。
E.2.1 磷酸盐缓冲液：pH 为 7.4。
E.2.2 标准品为 100nm 粒径的聚苯乙烯微球。
E.3 检测步骤
E.3.1 双击桌面快捷软件，窗口弹出按钮，点击 OK，仪器进行自动清洗。
E.3.2 用超纯水稀释 100nm PS 标准品，采用 5mL 注射器加样并进行校准；
E.3.3 校准结束后，选择标准品检测程序（PS100-488），对标准品进行检测；
E.3.4 标准品的粒径和浓度检测合格后，对样品进行稀释，采用 5mL 注射器加样检测；
E.3.5 检测结束后，点击仪器自动清洗 30s 后再进行手动清洗，确认样品池干净后，关闭仪
器，清理废液。
10
T/CRHA 081—2024
附 录 F
（规范性）
油橄榄叶囊泡纯度（每单位蛋白粒子数）计算方法
F.1 定义
囊泡纯度为每单位蛋白的粒子数，等于囊泡数量与蛋白量比值。
F.2 囊泡的数量检测
鼓励至少选择一项光学技术（附录 B、E）和一项非光学技术（附录 D）进行表征，即 B+D
或 E+D 的组合方法测定样品中囊泡的数量 X。
F.3 囊泡样品的蛋白量检测
用 BCA 试剂盒按照说明书测定样品的蛋白量 P。按照下列公式计算囊泡数量与蛋白量比值
T：
T=X/P
T——囊泡数量与蛋白质比值；
X——囊泡的数量；
P——囊泡的蛋白量。
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T/CRHA 081—2024
附 录 G
（规范性）
油橄榄叶囊泡促进上皮细胞/成纤维细胞增殖检测方法（CCK-8 法）
H.1 一般规定
H.1.1 按 SN/T 3899—2014 规定的规范培养细胞。
H.2 仪器和设备
H.2.1 多功能酶标仪。
H.2.2 CO2细胞培养箱。
H.2.3 细胞超净台。
H.3 试剂
本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为 GB/T 6682 规定的一级水。
H.3.1 磷酸盐缓冲液：pH 为 7.4。
H.3.2 商品化 CCK-8 试剂盒。
H.4 检测步骤
H.4.1 将上皮细胞/成纤维细胞细胞以 3000-5000 个细胞/孔的密度分别种植到 96 孔板中。
H.4.2 过夜培养后，实验组将油橄榄叶囊泡冻干样品复溶，检测粒子浓度，以终浓度 1×10 9
个颗粒/毫升加入细胞培养基中与细胞共孵育。对照组加入相同体积的磷酸盐缓冲液。
H.4.3 每日用商品化 CCK-8 试剂盒检测各组细胞生长情况，检测 4～5 天。
H.4.4 比较实验组和对照组的细胞生长曲线。
12
T/CRHA 081—2024
附 录 H
（规范性）
油橄榄叶囊泡促进上皮细胞/成纤维细胞划痕愈合检测方法
I.1 一般规定
I.1.1 按 SN/T 3899—2014 规定的规范培养细胞。
I.2 仪器和设备
I.2.1 无菌超净工作台。
I.2.2 6 孔板。
I.2.3 移液枪、枪头。
I.2.4 离心机、离心管。
I.3 试剂
本方法所用试剂均为分析纯，除特别说明外，实验用水均为 GB/T 6682 规定的一级水。
I.3.1 无血清培养基。
I.3.2 磷酸盐缓冲液：pH 为 7.4。
I.3.3 胰酶消化液。
I.4 检测步骤
I.4.1 消化。取出健康的上皮细胞/成纤维细胞细胞，用无菌磷酸盐缓冲液清洗细胞。加入
1mL 胰酶消化液消化细胞，显微镜下观察细胞。
I.4.2 离心。收集细胞悬液于离心管中，800-1000rpm/min 室温离心 5min。用细胞计数仪进
行计数或经验判断数量，接着弃去上清，加入培养基重悬细胞。
I.4.3 接种。以每孔约 5×10
5的细胞密度接种到 6 孔培养板上，补足培养基后在培养箱中
培养。
I.4.4 划痕。培养到汇合度约 80%时候，取出铺满 6 孔板的细胞，用 20μL 枪头垂直于孔板
表面，垂直于背面的横线划痕，由孔一端划向另一端，此时可在培养皿表面看到“#”字形
划痕。
I.4.5 磷酸盐缓冲液清洗细胞及培养。划痕完成后，吸掉旧培养基，用磷酸盐缓冲液洗细胞
表面 3 次，然后更换新鲜无血清或低血清(<2%)的培养基为对照组，油橄榄叶囊泡培养基为
实验组，放入 37℃，5%CO2培养箱中培养。
I.4.6 结果观察。在适当的时间点，如 0，6，12，24 小时后取出细胞，在显微镜下观察痕
道宽度并拍照后，用软件分析痕道宽度和划痕面积，比较不同时间点的划痕愈合率。
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T/CRHA 081—2024
参
考 文 献
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