ICS 07.030 G 30
GB
中华人民共和国国家标准
GB/T360822018/IS0/TS14101:2012
纳米技术 特定毒性筛查用金纳米颗粒
表面表征 傅里叶变换红外光谱法
NanotechnologiesSurface characterization of gold nanoparticlesfor nanomateria
specific toxicity screening-FT-IR method
(ISO/TS 14101:2012,Surface characterization of gold nanoparticles for nanomaterial specific toxicityscreening:FT-IRmethod,IDT)
2018-10-01实施
2018-03-15发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
发布 GB/T36082—2018/ISO/TS14101:2012
目 次
前言引言
范围规范性引用文件术语和定义符号和缩略语样品制备
2
3
4
5
6FT-IR测试程序
应用举例附录A（资料性附录） 验证配体交换的实例· 附录B（资料性附录） 金纳米颗粒表面结合生物化学分子的定性分析实例附录C（资料性附录） 窗片材料选择指南. 参考文献
10
12
14 17 18 GB/T36082—2018/ISO/TS14101:2012
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准使用翻译法等同采用ISO/TS14101：2012《特定毒性筛查用金纳米颗粒表面表征：傅里叶变
换红外光谱法》。
与本标准中规范性引用的国际文件有一致性对应关系的我国文件如下：
GB/T32269：2015纳米科技纳米物体的术语和定义纳米颗粒、纳米纤维和纳米片 (ISO/TS27687:2008,IDT)。
本标准作了如下编辑性修改：
为与归口标准化技术委员会现有标准系列一致，将标准名称修改为《纳米技术特定毒性筛查用金纳米颗粒表面表征傅里叶变换红外光谱法》；符号和缩略语中，由于g为重力加速度，Xg为相对离心力单位符号，因此将X去掉； -5.1.3中，为符合离心操作要求，将样品体积1.5mL修正为1mL；附录A中，根据柠檬酸盐分子结构，增加注，建议将C一O的振动模式改为COO的振动模
一
式；根据红外光谱振动频率分类规则，增加注，建议将1581cm-1C一O伸缩改为COO反对称伸缩，将1396cm-1羧酸C—O—H弯曲改为C—OH弯曲和COO对称伸缩，将1257cm-1 羧酸C一O伸缩改为C一C伸缩振动，将1111cm-1醇C一O伸缩改为醇和醚的C一O伸缩振动； 7.2和附录B中，根据红外光谱振动频率分类规则，增加注，建议将3311cm-1N一H伸缩振动改为酰胺A带（N一H伸缩振动），将1653cm-1N一H弯曲改为酰胺I带（CO伸缩振动），将1550cm-1N一H弯曲改为酰胺IⅡI带（N一H弯曲振动）。
本标准由中国科学院提出。 本标准由全国纳米技术标准化技术委员会（SAC/TC279)归口。 本标准负责起草单位：国家纳米科学中心。 本标准参加起草单位：珀金埃尔默企业管理（上海)有限公司、北京大学。 本标准主要起草人：郭玉婷、葛广路、华瑞、翁诗甫。
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引言
金纳米颗粒由于尺寸、形状和表面配体易于控制，成为研究理化性质和细胞毒性之间关系的理想模型体系11-3]。在金纳米颗粒各种性质中，人们发现其表面配体特性，如化学组成、分子结构和结合分子的数量，对决定金纳米颗粒的行为起到重要作用，比如在溶液中聚集或团聚的程度、在细胞培养液中与生物分子的键合，以及对活细胞的毒性[-12]。另一方面，合成过程中的表面配体改性并不总是成功的，配体置换的程度宜在金纳米颗粒的特定细胞毒性测试前确定，以获得可靠和一致的结果
FT-IR（傅里叶变换红外）吸收光谱是纳米颗粒表面配体鉴定和定量分析的重要工具之一。采用
FT-IR方法可对结合在纳米颗粒表面的配体分子 子的结构和相对数量进行分析[13-20]。然而，金纳米颗粒是在水中合成的，且浓度很低，对测量结果的解释变得复杂。低浓度的金纳米颗粒测试得到的吸光度值很小，易受背景噪声或痕量杂质吸收的影响。 由于细胞毒性测试是在水相环境中进行的，所以如果想研究表面特性对金纳米颗粒毒性的影响，需要分析在水溶液中的金纳米颗粒表面存在什么物质。然而，水分子在很宽的波数范围内对红外光有很强的吸收，所以无法用红外光谱对浓度非常低的溶质进行分析。 因此有必要制定测试指南，使上述问题的影响最小化。在本标准中，力求制定一个检测干燥膜中的金纳米颗粒的表面结合化学基团的技术规范，以提供水溶液中金纳米颗粒的结合分子的信息。FT-IR测量程序的标准化将作为这一技术规范的基础，大量篇幅也将用于描述正确进行FT-IR分析所需要的样品制备过程。
1 GB/T36082—2018/ISO/TS14101:2012
纳米技术特定毒性筛查用金纳米颗粒
表面表征傅里叶变换红外光谱法
1范围
本标准规定了测试纳米材料细胞毒性实验前后鉴别于燥金纳米颗粒薄膜中表面结合分子的傅里叶
变换红外光谱法（FT-IR）。
注1：金纳米颗粒在测试之前表面可能已经结合了配体，在细胞毒性测试过程中也可能额外覆盖(或包覆)有机或生
物分子。
注2：采用傅里叶变换红外光谱法分别检测磷酸二酯、胺或脂质的有关吸收谱带，可以分别确定结合在金纳米颗粒
上的核酸、氨基酸、脂质或细胞膜的成分，但核酸、蛋白质或脂质的类型不能通过红外光谱具体确定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件
ISO/TS27687纳米科技纳米物体的术语和定义纳米颗粒、纳米纤维和纳米片（Nanotechn ologiesTerminology and definitions for nano-objectsNanoparticle,nanofibre and nanoplate)
3术语和定义
ISO/TS27687界定的以及下列术语和定义适用于本文件。为了便于使用，以下重复列出了 ISO/TS27687中的一些术语和定义 3.1
衰减全反射模式 attenuated total reflection mode ATR模式一种仪器工作模式，在该模式下红外光在晶体内的人射角要大于临界角注：红外光在晶体的上表面被完全反射，其强度由于覆盖在晶体上表面材料的吸收而衰减。吸收的红外光额率用
来确定化学基团，吸光度用于确定化学基团的数量。
3.2
透析dialysis 小分子或离子通过薄膜扩散与溶液中的大分子或悬浮物分离的过程。 [ISO6107-2:2006，定义38]
3.3
傅里叶变换红外光谱Fouriertransforminfraredspectroscopy;FT-IR 基于样品中化学基团对红外辐射的吸收，以鉴别和定量化学基团的一种分析化学技术，
3.4
检出限limitof detection LOD 根据给定的测量程序得到的测量值，β为由测量值漏报某种成分的概率，为误报的概率。
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注1：引自ISO/IEC指南99：2007，定义4.18 注2：根据IUPAC推荐，α和β值均取0.05，重复5次空白实验标准偏差的2.776倍即为LOD。 注3：参见ISO17191。
3.5
定量下限 limit of quantification;LOQ 被测样品在可接受的准确度和精密度下能检测到的最低值。 注1：LOQ可以确定为光度噪声标准偏差的10倍值，对于最小信号水平A将给出相对精确度A/A≤10%。 注2：参见参考文献[24]。
3.6
截留分子质量 molecular weight cut-off value;MWCO 经过16h的透析后，截留量超过90%以上溶质的分子质量。 注：参见参考文献[25]和[26]。
3.7
纳米物体 nano-object -维、二维或三维外部维度处于纳米尺度的物体。 注：用于所有相互分离的纳米尺度物体的通用术语 [ISO/TS27687:2008，定义2.2]
3.8
纳米颗粒 nanoparticle;NP 三个外部维度都在纳米尺度的纳米物体注：如果纳米物体最长轴和最短轴的长度差别显著（大于3)时，用纳米棒或纳米片来表示纳米颗粒。 [ISO/TS27687:2008，定义4.1]
3.9
纳米尺度 nanoscale 处于1nm～100nm之间的尺寸范围。 注1：本尺寸范围通常、但非专有地表现出不能由较大尺寸外推得到的特性。对于这些特性来说，尺度上、下限值是
近似的。
注2：本定义中引人下限（约1nm)的目的是为了避免在不设定下限时，单个或一小簇原子被默认为是纳米物体或
纳米结构单元。 [ISO/TS27687:2008，定义2.1]
3.10
预检（合格的）蒸馏水 pre-tested distilled water;DW 经过FT-IR检测，证实不含红外吸收杂质的有效蒸留水。
3.11
相对离心力 relative centrifugal force;RCF 相对于地球重力的加速度力。
3.12
表面等离激元共振带 surface plasmon resonance band;SPR 由固体表面附近区域内的电子集体振荡产生的吸收的光的频率范围。 注：SPR发生在金属薄膜或金属纳米颗粒中。
4符号和缩略语
下列符号和缩略语适用于本文件。
2 GB/T36082—2018/ISO/TS14101:2012
AuNP：金纳米颗粒 IR:红外 MW：分子质量 SCM：含血清的介质 UV/Vis：紫外/可见 g：地球的重力加速度，作为相对离心力的一个参考单位
5样品制备
5.1去除未结合的分子 5.1.1通则
由于FT-IR吸收光谱测量的是样品膜中所有分子，所以在制备样品膜前，除溶剂外，所有未结合的红外活性分子都需要从溶液中去除，以便正确检测结合在金纳米颗粒表面的分子。 5.1.2透析
透析是一种采用合适的截留分子质量的膜将未结合分子与金纳米颗粒有效分开的方法。正确使用时，透析膜可以按照样品和透析液的体积比来降低透析后未结合分子的浓度，一般情况下可截留90% 以上的纳米颗粒。建议截留分子质量小于被保留物质分子质量的一半，天于穿过透析膜物质分子质量的3倍。由于透析膜的效率取决于分子的电荷和形状，透析膜去除未结合分子的效率应在分离金纳米颗粒和未结合分子之前进行验证。在效率测试前，需要对透析膜进行测试，看它是否存在红外吸收杂质。杂质测试流程如下：
a）将0.5mL～3mL的DW装人透析袋中。 b) 将装有DW的透析袋用合适的夹子封好，在DW（体积≥600mL)水浴中透析16h。 c) 使用溶剂浸湿的棉签清洁ATR晶体或IR窗片的表面。 d) 从透析袋中取出所需体积（2μL或≥200μL)的液体。 注：ATR方法使用2μL，透射方法使用量≥200μL. e） 将所取液体滴在ATR晶体或IR窗片上，在脱水室中干燥（见5.2），这一过程称为滴干。
采用6.2或6.3的程序测试溶解在所取液体中任何潜在杂质的FT-IR光谱 g） 如果在关注的频率范围内红外谱带没有高出检出限，则认为透析膜没有红外活性杂质。 这种无红外活性杂质影响的膜可用于透析。检测透析效率的流程如下： a) 将0.5mL～3mL仅含有能通过透析膜的分子的溶液装入透析袋中；
通过透析膜的分子为交换前和交换后的表面配体，或血清中的生物分子，或键合实验中的细胞提取物；样品溶液的浓度根据表面配体在纳米颗粒悬浮液可以存在的最大数量设定。这个值可能与交换过程中的配体分子添加量相等，或者由表面的金原子数估计，这可由晶格常数[27] 和金纳米颗粒的直径计算得到。配体分子的最大数目是假设在配体之间无空间位阻条件下单层键合时表面上的金原子个数
b）将装有样品的透析袋用合适的夹子封好，在DW（体积≥600mL)水浴中透析16h。 c) 从透析袋中取出所需体积（2uL或200uL)的样品 d) 在ATR晶体或IR窗片上滴干样品溶液。 e) 采用6.2或6.3的程序测样品膜的FT-IR光谱。 f) 从水浴中取出所需体积（2μL或≥200μL)的样品
3 GB/T36082—2018/ISO/TS14101:2012
g) 在ATR晶体或IR窗片上滴干样品溶液。 h): 采用6.2或6.3的程序测试样品膜的FT-IR光谱，
比较步骤e)和h)得到的光谱。如果两个光谱都没有高于LOD的谱带，提高样品溶液浓度重复测试。由于透析袋和水浴中的样品在经过适当透析后具有相同的组分，所以如果它们的谱带都高于LOD并且强度在测试不确定度范围内相等，则认为膜是有效的。
i)
5.1.3离心
离心法可以用于分离金纳来颗粒与未结合的分子，尤其是当未结合的分子的分子质量太大找不到
合适的截留分子质量透析膜时。离心速度不足将导致金纳米颗粒悬浮在上清液中，这可以从使用紫外/ 可见吸收光谱观察到的SPR谱带吸收来确定。离心速度过高将导致未结合的分子沉降。在使用离心方法进行FT-IR分析时，要确保溶液中重新悬浮的金纳米颗粒有足够的浓度。紫外/可见吸收光谱的 SPR谱带能提供有效沉降和重新悬浮的信息。如果未结合分子的吸收谱能从SPR吸收区中排除，聚集/团聚程度则可通过金纳米颗粒的SPR吸收带变宽来估计。
为了保证金纳米颗粒有效地沉降而不受未结合分子的干扰，确定离心力和离心时间组合的程序如下：
a) 将1mL的金纳米颗粒溶液置于2mL的微量离心管中。 b) 采用表1中推荐的离心力和离心时间离心沉降金纳米颗粒。 c) 尽可能多地移走管中的上清液，而不扰动沉积物；以DW为参比测量400nm～750nm范围内
上清液的紫外/可见吸收光谱：
在探讨未结合分子的吸收情况时，检查金纳米颗粒的SPR谱带是否出现。
d) 如果SPR谱带的吸光度最大值高于0.05，即紫外/可见光谱定量分析的低限28]，增加离心力
或离心时间20%，重复步骤a～c)[28]。 e) 如果SPR谱带的吸光度最大值低于0.05，沉降所需的离心力和离心时间已经足够
表1金纳米颗粒沉降所推荐的相对离心力和离心时间与颗粒直径的函数关系
样品体积 mL
相对离心力
离心时间 min 60 20 20 20 20
金纳米颗粒直径
×g 19 000 10 000 5 000 2 000 1 000
nm 5 15 30 50 100
1 1 1 1 1
确定离心力和离心时间上限的程序如下： f) 将1mL除了金纳米颗粒外含有所有其他组分的溶液，如交换前后的自由配体溶液、SCM或
细胞提取物，置于2mL微量离心管中。 g） 按照步骤a)～e)确定的离心力和离心时间进行离心。 h) 取1mL不包含任何潜在沉积物的上清液。 i) 取所需体积（2uL或≥200μL）上清溶液；置于ATR晶体或IR窗片上滴干溶液，并测量FT
IR光谱。 j) 振荡离心管中剩余溶液，取所需体积（2μL或≥200μL)剩余溶液，置于ATR晶体或IR窗片
上滴干溶液，并测量FT-IR光谱。
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